Avvikende trombocytter

Transkript

1 Avvikende trombocytter Overbioingeniør Henriette Kuvås, Sykehuset innlandet Gjøvik. Medlem av RUMBIO (Rådgivende utvalg for medisinsk biokjemi, hematologi og koagulasjon) Gjøvik sykehus Sykehuset innlandet (SI) består av sykehusene i Oppland og Hedmark fylke. Gjøvik har behandling for kreft, strålebehandling og hematologisk poliklinikk. Laboratoriene i SI samarbeider om felles prosedyrer. 1

2 Fokus på lave trombocytter Innledende om trombocytter Måleteknologier med interferens Studier mellom måleteknologier Rutiner i Norge rundt lave trombocytter Pasientkasus Trombocytter Trombocytter dannes ved avsnøring av megakaryocyttens cytoplasma og har en levetid på 9 10 døgn. Trombocytter er viktig i den primære hemostase. Indikasjoner: Utredning av blødningstilstander og myeloproliferative tilstander. Mistanke om disseminert intravaskulær koagulasjon (DIC). Kontroll ved cytostatikabehandling. Kilde: 2

3 Prøvetaking Trombocytter EDTA blod. Unngå langvarig stase. Evt. 3,2 % natrium citrat rør ved pseudotrombocytopeni i EDTA blod. Kilde: Trombocytter Referanseområde: x10 9 /L Nyfødte og barn under 1 år har litt bredere referanseområde ( x 10 9 /L). Trombocyttantallet stiger etter kraftig muskelarbeid. Hos kvinner sees noe lavere antall trombocytter de første dagene i menstruasjonssyklus Kilde: 3

4 NASJONALE RETNINGSLINJER Alvorlig TPK < 10 Behandlingsindikasjon. Moderat TPK Behandling dersom økt blødningsrisiko. Mild TPK Behandling dersom klinisk relevant blødning eller betydelig økt blødningsrisiko. Krav til metoder Ved trombocytopeni er høy nøyaktighet og høy presisjon av lave platetall viktig for kliniske avgjørelser. 4

5 Trombocytter Store trombocytter. Måleteknologier for trombocytter Instrument Måleteknologi Måleområde Celldyn sapphire UnicellDxH 800 coulter Sysmex XN PLT I (Impedanse), PLT O (optisk) CD 61 (immunologisk) Impedanse PLT I (impedanse), PLT O (optisk) PLT F (fluoresc. Oxazine) Advia 2120i PLT O (Optisk ) Pentra DX Impedanse nexus 5

6 Instrumenter Celldyn Sapphire Uni cel 800 Sysmex XN Advia Pentra Interferens på trombocytter CD61 PLT F Små røde x x x x x Store plater x x x x x Cellefragmenter x x x x x x Autoagglutiner x x x Kuldeagglutiner x x x x Kryoglubuliner x Plateaggregeringer x x x x x x x Glanzmann trombasteni x Humane anti museantistoffer x Høye lipider x x Høy bilirubin x Kjemoterapi x Hemolyse x RBC inklusjoner x Trombocytt interferens Gir høyt telletal Cellefragmenter: Leukocytter, blast eller rødefragmenter Små røde Lipemi Gir for lavt telletall Store trombocytter Trombocyttaggregering i EDTA blod Kuldeagglutiner 6

7 Sammenligning av måleteknologier studie 1 Comparison of Automated Differential Blood Cell Counts From Abbott Sapphire, Siemens Advia 120, Beckman Coulter DxH 800, and Sysmex XE 2100 in Normal and Pathologic Samples Et studie i Tyskland med 202 prøver fra normale og hematologiske pasienter. KIlde: Hematopathology / Automated Differential Blood Count Am J Clin Pathol 2013;139: DOI: /AJCP7D8ECZRXGWCG studie 1 KIlde: Hematopathology / Automated Differential Blood Count Am J Clin Pathol 2013;139: DOI: /AJCP7D8ECZRXGWCG 7

8 Comparison Abbott Sapphire, Siemens Advia 120, Beckman Coulter DxH 800, and Sysmex XE 2100 studie 1 Det er god korrelasjon mellom metodene r 2 >0.99 Tpk tall for Celldyn sapphire og Advia 120 var over gjennomsnittet og DxH 800 og Sysmex XE 2100 under gjennomsnitt. Det er spesielt de lave trombocyttene som er transfusjonsviktige. Et studie med 32 prøver med tpk under 25 x10 9 /L var korrelasjonen lavere r 2 >0.87 KIlde: Hematopathology / Automated Differential Blood Count Am J Clin Pathol 2013;139: DOI: /AJCP7D8ECZRXGWCG studie 1 PLTb PLT <25 x10 9 /L r 2 r 2 Celldyn sapphire Advia Sysmex XE DxH KIlde: Hematopathology / Automated Differential Blood Count Am J Clin Pathol 2013;139: DOI: /AJCP7D8ECZRXGWCG 8

9 Uni Cel DxH 800 Coulter Studie 2 utført på Gjøvik sykehus PRESISJON Repeterbarhet lave trombocytter pasientprøver n=20 mean 10 CV 4,6% mean 34 CV 4,6% mean 50 CV 3,2% Reproduserbarhet trombocytter på kontrollmateriale n=20 mean 70 CV 1,8% mean 200 CV 1,9% mean 400 CV 1,9% CV i følge biologisk variasjon database for ønsket er < 4,55 % dette klarer DxH i det lave område PLT CVBW 9,1 x 0,5 = 4,55 Uni Cel DxH 800 Coulter Studie 2 utført på Gjøvik sykehus TPK: CELL DYN Sapphire Optisk mot DxH 800 Impedanse Regresjonsmetode Passing & Bablok OLR Deming, uvektet Deming, vektet Stigningstall med 95 % CI 0,8527 0,8424 0,8620 0,8570 0,8477 0,8663 0,8577 0,8441 0,8713 0,8424 0,8349 0,8499 Skjæringspunkt med 95 % CI 0,046-1,748 1,681-0,356-3,477 2,765-0,552-3,241 2,137 2,074 1,398 2,749 s e Lineær (p>0.10) 8,807 3,3 % Foreslått Brukt Foreslått Brukt u x u y 0 0,66 0,49 Nivå ,31-21,09-23,28-18,90-21,19-22,56-19,81-20,77-21,76-19,79 Nivå ,41-56,13-58,30-53,97-56,05-59,30-52,80-59,38-62,07-56,69 Antall Konst. vekt NKK regneark for regresjon. Hvert instrument er kalibret med kalibrator fra sitt firma 9

10 Uni Cel DxH 800 Coulter Studie 2 utført på Gjøvik sykehus TPK CD61 CELL DYN Sapphire mot DxH 800 Impedanse, (Tpk verdi 2,73 106) Regresjonsmetode Passing & Bablok OLR Deming, uvektet Deming, vektet Stigningstall med 95 % CI 0,8274 0,7652 0,8712 0,8113 0,7612 0,8614 0,8141 0,7417 0,8864 0,8417 0,6791 1,0043 Skjæringspunkt med 95 % CI 1,247-0,404 2,614 1,751-0,486 3,988 1,663-0,805 4,131 1,263-0,541 3,066 s e Lineær (p>0.10) 2,597 8,2 % Foreslått Brukt Foreslått Brukt u x u y 0 1,00 1,00 Nivå 1 5 0,38 0,81-1,26 2,88 0,73-1,48 2,95 0,47-0,96 1,90 Nivå ,20-2,02-3,71-0,34-2,06-3,77-0,34-1,90-4,43 0,62 Antall Konst. vekt NKK regneark for regresjon. Hvert instrument er kalibret med kalibrator fra sitt firma Uni Cel DxH 800 Coulter Studie 2 utført på Gjøvik sykehus Vår innkjøring av DxH gir samme resultat som studie 1. Trombocytter på DxH ligger lavere enn CellDyn Sapphire optisk eller CellDyn sapphire optisk ligger høyere enn DxH. Det er større forskjell på tpk i det høye område. I det lave område stemmer tpk DxH 800 bra overens med CD61 analysert på CellDyn sapphire. I sykehuset innlandet er CellDyn sapphire hovedinstrument og i rutinen er DxH kalibrert opp i mot CellDyn sapphire og vil dermed gi tilnærmet samme resultat. 10

11 Fluorescent Method (PLT F) on Sysmex XN2000 Studie 3 New Fluorescent Method (PLT F) on Sysmex XN2000Hematology Analyzer Achieved Higher Accuracy in Low Platelet Counting 32 prøver K 2 EDTA med plater under 50 x 10 9 /L. Prøver uten plateklumpmeldinger og utstryk ble laget for WBC og RBC cellefragmenter, mikrocytose, store plater og plateklumper. Prøvene ble analysert på Sysmex XN 2000, Sysmes XE 2100 og mot CD 61 Beckman Coulter FC 500 flow cytometer Schoorl_ indd American Society for Clinical Pathology DOI: /AJCPUAGGB4URL5XO Fluorescent Method (PLT F) on Sysmex XN2000 Studie 3 However, for samples from patients undergoing chemotherapy, the impedance count will yield more accurate results. Deviations are probably caused by the staining of white cell fragments after apoptosis. Schoorl_ indd American Society for Clinical Pathology DOI: /AJCPUAGGB4URL5XO 11

12 Fluorescent Method (PLT F) on Sysmex XN2000 Studie 3 Det er god reproduserbarhet på PLT F i forhold til PLT Iog PLT O i nivå tpk 20 x 10 9 /L er henholdsvis cv 3,0%, 9,3% og 8,5% (n=10) Det er bra overensstemmelse mellom PLT O og PLT F, PLT F stemmer bedre overens mot CD61 enn PLT O, mulig årsak er den gode CV for PLT F PLT F ligger lavere enn CD61 PLT F er en pålitelig metode for lave trombocytter da ikke alle laboratorier har CD61 og ved transfusjons område 20 x 10 9 /L er da PLT F den foretrukne metode på Sysmes XN. Schoorl_ indd American Society for Clinical Pathology DOI: /AJCPUAGGB4URL5XO Comparison of Automated Platelet Counts and Potential Effect on Transfusion Decisions in Cancer Patients Studie prøver fra pasienter med kreft og med plater under /L analysert på Advia 2120i, Sysmex XE 2100 og Cell dyn Sapphire. I kreftbehandling gis ofte dypt myelosuppressiv kjemoterapi i et forsøk på å oppnå en maksimal antitumoreffekt. Pasientene er igjennom perioder med cytopenia American Society for Clinical Pathology Am J Clin Pathol 2013;140: DOI: /AJCP58INTITVGQZI 12

13 Comparison of Automated Platelet Counts and Potential Effect on Transfusion Decisions in Cancer Patients Studie 4 Standard retningslinjer, pasienter med ukomplisert trombocytopeni kan transfunderes når plateantallet faller under / L. Pasienter som er febril eller har andre medisinske tilstander som øker risiko for blødning kan kreve en høyere terskel overføring. American Society for Clinical Pathology Am J Clin Pathol 2013;140: DOI: /AJCP58INTITVGQZI Comparison of Automated Platelet Counts and Potential Effect on Transfusion Decisions in Cancer Patients Studie 4 Dette krever nøyaktige svar med god presisjon i det lave området, men det er det ikke alltid instrumentene gir, ser ofte interferens av partikler som ikke er blodplater Gir høyt telletall Cellefragmenter Små røde Gir for lavt telletall Store trombocytter Trombocyttaggregering Dette kan resultere i enten undertransfusjon (referanse 10,rapportert verdi> 10) overtransfusjon (referanse> 10, rapportert verdi 10) av blodplater. American Society for Clinical Pathology Am J Clin Pathol 2013;140: DOI: /AJCP58INTITVGQZI 13

14 Comparison of Automated Platelet Counts and Potential Effect on Transfusion Decisions in Cancer Patients Studie 4 CD61 blir ofte oppgitt som referanseverdi, derfor ble 36 prøver telt i fasekontrast mot CD61 Resultatene viste god overensstemmelse mellom CD61 og referansemetoden telling av trombocytter med fasekontrast American Society for Clinical Pathology Am J Clin Pathol 2013;140: DOI: /AJCP58INTITVGQZI 14

15 Comparison of Automated Platelet Counts and Potential Effect on Transfusion Decisions in Cancer Patients Studie 4 Resultater: Alle metoder viste en positiv skjevhet, spesielt på mindre enn 20 x 10 9 /l og mindre enn 10 x 10 9 /l og dermed risiko for undertransfusjon. Telle tpk i fasekontast er ressurskrevende og har dårlig presisjon Kvantifisering av blodplater merket med anti CD41 og CD61 har vist seg være ekstremt nøyaktig og reproduserbart, selv ved sterk trombocytopeni. Konklusjon: Selv om optiske og impedansemetoder viste seg å være feilaktig økt i alvorlig trombocytopeni, krever det flere studier for å fastslå om mer nøyaktige metoder ville være av klinisk nytteverdi. American Society for Clinical Pathology Am J Clin Pathol 2013;140: DOI: /AJCP58INTITVGQZI Vi ønsker minst mulig telling av trombocytter i mikroskop 15

16 Rutiner fra flere sykehus i Norge rundt lave trombocytter Spørsmål generelt om trombocytter Hvilke typer instrumenter har dere? Har dere autovalidering av prøvesvar? Hvis ja, hva er nedre og øvre grense for autovalidering av trombocytter? Hva er nedre svargrense for å gi ut trombocyttsvar på instrumentet? Instrument Autovalidering av tpk svar Nedre autovalidering av tpk x10 9 /L Øvre Autovalidering av tpk x10 9 /L Nedre svarsgrense x10 9 /L SI Gjøvik CellDyn Sapphire DxH 800 Coulter Nei Ja Optisk 5 CD Radiumhospitalet CellDyn Sapphire Advia 2120i Nei Ja Hemalink LKB Bergen Sentrallab: 3 CellDyn Sapphire Advia Nevro/lab: CellDyn Ruby Kvinneklinikken: Advia 2120i Barneklinikken: CellDynSapphire Ingen autovalidering CellDyn Sapphire: 5 10*9/L Advia: 50 10*9/L CellDyn Ruby: 40 10*9/L 16

17 Instrument Autovalidering av tpk svar Nedre autovalidering av tpk x10 9 /L Øvre Autovalidering av tpk x10 9 /L Nedre svarsgrense x10 9 /L ST Olav Trondheim Sysmex XN 9000 Sysmex XP 300 Advia 2120i CellDyn sapphire ABX Micros ES 60 Sysmex XN9000, CellDyn Sapphire Plt F: 1 CD61: 1 Rikshospitalet OUS Tromsø 2 stk CellDyn Sapphire Sysmex XN 9000 XN1000 (BK Lab) Sysmex XN 2000 og 1000 Ja/Nei. ca 60% blir autovalidert men vi ser på alle plot) Ja Spørsmål om lave trombocytter: Har dere en lav tpk aksjonsgrense for første gangs undersøkelse, hvis ja hva blir gjort? Ringegrense for lave trombocytter: Rutiner dere har rundt lave tpk svar: Når instrumentene ikke klarer å gi rett tpk svar eller når dere tviler på svaret, hva gjør dere videre: Har dere CD61? hvis ja, er det Celldyn sapphire eller annet flow, skriv opp navnet på flow instrumentet? hvilke kriterier har dere for bruk av CD61? Har dere manuell telling av trombocytter i mikroskop? hvis ja, blir det utført som rutine/av alle? 17

18 Lav tpk aksjonsgrense for første gangs undersøkelse SI Gjøvik Radiumhospitalet OUS LKB Bergen ST Olav Trondheim Rikshospitalet OUS Tromsø Tpk <100 kontrolleres på et annet instrument. Alle tpk <100 x10 9 /L skal analyseres på begge maskiner Flytskjema tpk<50, tpk vurderes kurver evt CD 61. Ukjent kontrolleres resultatet og tpk<50 første gang kontrolleres svaret i mikroskop og ser etter aggregering. <100 x10 9 /L, sjekker blodutstryk for aggregering < 100 omkjøring, < 50 aggregeringskontroll (Unntak blodsykdommer,barneonkologisk avd). Ukjente lave blir sjekket i mikroskop (bloddråpe på utstryksglass med dekkglass over). Ringegrense verdi for lave trombocytter Ukjente Har dere har CD61 Manuell telling av trombocytter i mikroskop SI Gjøvik <50 x10 9 /L Ja CellDyn Sapphire Nei Radiumhospitalet <20 x10 9 /L Ja CellDyn Sapphire Nei Kriterier: Vanligvis hvis ukjent lavt tpk resultat (<50 x10 9 /L og Advia Sapphire avviker fra hverandre, og/ eller stygge kurver/plot (som regel kombinert med lavt resultat) LKB Bergen <20 x10 9 /L Ja CellDyn sapphire Ja og alle læres opp. ST Olav <50 x10 9 /L Ja, CellDyn Sapphire Ja Alle er trent Rikshospitalet <20 x10 9 /L Ja CellDyn Sapphire Kriterier: Dårlig kurve/proteinsky/andre synlige interferenser (fragmenter, lipemi). Kun på BK Lab Utføres av ca 10 bioingeniører av 45 vaktgående. Tromsø <50 x10 9 /L Nei, dessverre. Ja nesten alle læres opp 18

19 Rutiner rundt lave tpk svar SI Gjøvik Radiumhospitalet LKB Bergen ST Olav Svaret kontrolleres mot tidligere svar. Om på annet instrument og plot vurderes,cd61 Alle <100 x10 9 /L skal alltid analyseres på begge maskiner uansett om det er første gang eller 10. gang. Dersom resultatene avviker veldig mellom de to maskinene, vurderes tiltak ut i fra hvordan plot ser ut. Flytdiagram for Tpk <50,plot vurderes evt CD61 <20 målt i impedansekanal på Sysmex XN 9000 reanalyser på Sysmex plt F, ADVIA2120 el. CellDyn Sapphire. Tpk<100 x 10 9 /L. Immunologisk metode med CD 61 på CellDyn Sapphire benyttes dersom aggregering ikke er påvist og trombocytt histogram/ scatterplot ikke stemmer med kriteriene. Dette kan skyldes interferensproblematikk (proteinfragmenter, lipemi, wbc fragmenter, rbc fragmenter o.a.) Også ved mistanke om forekomst av abnormalt små(mpv< 9fL) el. store trombocytter (MPV >12fL). Alternativt må trombocytter telles manuelt i mikroskop. Rikshospitalet Tromsø Omkjøringer, koagelsjekk, CD61 Rerun med PLT F Når instrumentene ikke klarer å gi rett tpk svar, eller når dere tviler på svaret, hva gjør dere videre? SI Gjøvik Radiumhospitalet LKB Bergen ST Olav Rikshospitalet Aggregeringskontroll, CD61 avhengig av plot og ingen aggregering Varierer avhengig av plot, men tiltak er ofte aggregeringskontroll i utstryk, og deretter evt CD61 hvis vi ikke finner aggregater (gjøres vanligvis kun når lave tpk). Noen ganger gjøres kun en av tiltakene avhengig av plot og flagg Om CD61 feiler er det telling i mikroskop som er fasit Sammenholder resultatene fra alle aktuelle metoder, vurderer i forhold til hva vi ser i utstryk, ulike problemstillinger gir ulike konklusjoner i forhold til hvilken metode som er riktig CD61 Tromsø Teller manuelt i ammuniumoxalat 19

20 Spørsmål om trombocyttaggregering Stoler dere på meldingen som instrumentene gir? Hvis forskjellige typer av instrumenter, skriv for hvert enkelt. Tas prøven om i citratblod (INR eller SR rør), skriv hvilket rør som brukes? Lager blodutstryk for å se etter plateklumper? Legger prøven opp for manuell telling i mikroskop for å se etter plateklumper? Hvordan rapporteres svaret? SI Gjøvik Radiumhospitalet OUS Stoler man på plateklump meldingen på instrumentene Ja og nei avhengig av plot utseende og svar Ja avhengig av plotutseende og svar Tas prøven om i citrat? INR x1,1 SR rør x1,25 Lager blodutstryk for å se etter plateklumper INR/SR Ja Nei Bruker Canamycin, INR Ja Legger prøven opp for manuell telling i mikroskop for å se etter plateklumper Nei LKB Bergen Ålesund Sysmex XN ST Olav Trondheim Ja og nei INR/SR Ja, ved tvil Ja. Vi teller ikke tpk, men ser etter aggregering. Nei sjekker alle <145 med flag <120 uten flag Flag meldingen overses ved tpk >100 Helst SR rør, kan også bruke INR Ja Ja Nei Rikshospitalet OUS Nei/ja, avhengig av plotutseende. Nei bruker Canamycin Ja Nei (ikke pr.idag) Tromsø Til dels. INR Ved tvilstilfeller Nei 20

21 Hvordan rapporteres tpk svaret ved aggregering? SI Gjøvik Trombocytter målt til 150 gis fast kommentar: Trombocytter målt til 150 X 10^9/ aggregater interferer. Ny prøve må tas i både EDTA og NaCitrat glass. Tpk svar <150 utgis ikke tallverdi. Alle inneliggende pasienter tas om. Radiumhospitalet OUS LKB Bergen Hvis funn av aggregater: Fastkommentar "Eksakt resultat kan ikke utgis pga aggregering. Trombocytter er <..." (...= målt verdi). Dersom vi har kontrollert for aggregering, men ikke funnet noe, utgis resultatet med kommentaren " Prøven er kontrollert for trombocyttaggregering, men ingen aggregering ble observert" Standardkommentar for aggregering: Tpk> xx 10*9/L. Nøyaktig svar kan ikke utgis pga trombocyttaggregering. Hvordan rapporteres svaret tpk svar ved aggregering Ålesund Legger inn kommentar. Dersom pasienten nylig er sjekka uten funn av plateklumper, trenger vi ikkje å sjekke igjen i blodutstryk. ST Olav Trondheim Dersom ingen aggr.: I svarfelt : #tallverdi#. Fastkommentar. Kontrollert i utstryk, ingen trombocyttaggregering. Dersom aggr.: I svarfelt : #tallverdi#. Fastkommentar. Falsk for lavt resultat pga. aggregering av trombocytter i prøven. Dersom massiv aggr.: I svarfelt : Slett. Fastkommentar. Resultat av trombocytt analyse kan ikke utgis pga. massiv trombocytt aggregering i prøven. EDTA antistoff? For kontroll av resultat anbefales kontrolltelling i nytappet citrat blod (SR rør). 21

22 Hvordan rapporteres svaret tpk svar ved aggregering Rikshospitalet OUS Tromsø Ved funn av aggregater i utstryk: Eksakt resultat kan ikke utgis pga. trombocyttaggregering. Trombocyttresultatet er > Kontrolleres > 2mnd. Ved negativt funn i utstryk: Prøven er kontrollert for trombocyttaggregering, men ingen aggregering ble observert. Kontroll > 2mnd. Canamycin: 400uL blod ul Canamycin. Aggregatene vil som oftest da løses opp helt eller delvis. Svarutgivelsen blir da: TPK står i svarfeltet og med kommentar: Det er observert plateaggregering i prøven. Prøven er reanalysert etter tilsetning av canamycin som kan reversere aggregater. Platetallet kan likevel være falskt for lav. Ikke akkreditert metode. Mye klumper: seponeres analysen. Litt klumper. Vurderer om svaret kan gis ut som «større enn» og med kommentar om klumper. Pasient kasus Mann 50 år vesentlig frisk fra før Slapp i noen måneder Hb 5,3 MCV 96 lpk 1,9 tpk 16 retik 24 Diagnose Myelodysplastisk syndrom (MDS) Benmarg 9 10% blaster Fibrose 2 av grad 3 22

23 Pasient kasus Sykdommen klassifiseres som høyrisk for å utvikle akutt myelogen leukemi (AML) kort forventet levetid viktig med behandling Induksjonsvæsker (2 cellegift typer i 7 dager) Aplasi i 3 uker tpk under 5 Regenerasjon, tpk henholdvis Er startet på en ny omgang med induksjonsvæsker og en ny aplasi fase Venter på ny benmarg Pasient kasus Trombocyttene var vanskelig å måle, optiske trombocytter gikk ikke på Celldyn og målingen på DxH kom med feilmelding. I dette tilfelle var løsningen CD61 for å kunne gi rett svar til behandlingen og transfusjon av trombocytter mens aplasi fasen pågikk. 23

24 Takk for oppmerksomheten! 24