RESULTAT FRA IN VITRO TESTING AV LAKSELUS FØLSOMHET FOR AQUI-S

Transkript

1 Bioassay rapport Dato: Sponsor: Lars Speilberg, Scanvacc Bioassay utført av: Ole Edvard Hagen, Fishguard RESULTAT FRA IN VITRO TESTING AV LAKSELUS FØLSOMHET FOR AQUI-S Editor: Lene Høgset, Fishguard Fishguard AS Skuteviksbodene 11, N-5035 Bergen. Telefon Fax E-post: post@fishguard.no

2 Oppsummering Aqui-S er i dag vanlig brukt som sederingsmiddel i forbindelse med brønnbåtavlusing med H2O2. Enkelte oppdrettere og veterinærer har sett en tendens til økt effekt av avlusingen når Aqui-S er brukt i forkant av H2O2 tilsetning. På bakgrunn av dette fikk Fishguard i oppdrag å utføre et bioassay med ulike konsentrasjoner av Aqui-S. Lusa ble plukket fra en lokalitet i Austfjorden i Hordaland der det er utfordringer med resistens. Resultat av bioassay viste at Aqui-S viser en tendens til å kunne inaktivere lus ved høyere konsentrasjoner av AquiS-S og at den biocidale effekten på lakselus øker med økende konsentrasjon av Aqui-S. Bergen; 28/ : Fagansvarlig veterinær 2

3 Innholdsfortegnelse Oppsummering... 2 Material og metode... 4 Lakselusas opphav... 4 Utførelse av bioassayet... 4 Resultat og diskusjon... 4 Addendum 1: Evaluation of the response... 8 Addendum 2: Statistics and evaluation of sensitivity... 9 Addendum 3: Statistical analysis; 90 minutes exposure time, after acclimatization in sea water

4 Material og metode Lakselusas opphav Lakselus (Lepeophtheirus salmonis) ble plukket fra en lokalitet med fisk satt i sjø høsten Lokaliteten ligger i Hordaland fylke i Austfjorden. I dette området er det utfordringer med nedsatt følsomhet for de fleste vanlig brukte legemidler mot lakselus. Bioassayet ble utført med pre-adulte lus (hannlus og hunnlus). Utførelse av bioassayet Sjøvann med en temperatur på 12 grader og salinitet på ca 26 promille ble brukt. Det ble brukt 10 lus per konsentrasjon og konsentrasjoner på 4, 6, 8 og 10 ppm Aqui-S. For hver av konsentrasjonene ble det brukt tre ulike eksponeringstider; 45 min., 90 min., og 3 timer. Avlesning (kategorisering av lus som aktiv eller inaktiv) ble gjort rett etter eksponering, og etter ett døgns akklimatisering i rent sjøvann. Aqui-S ble tatt direkte fra 4 liters kanne, batchnr. B , exp.date 7/ Tillagning av stamløsning ble gjort på følgende måte: Stamløsning på 1:100 ble laget av 10 ml Aqui-S tilsatt 990 ml sjøvann. Den ble blandet godt til hvit, homogen emulsjon. Av stamløsningen ble det tatt ut 1 ml som ble tilsatt 99 ml sjøvann, slik at vi fikk en bruksløsning på 1:10.000, som ble blandet til homogen løsning. Fortynningsserie: 10 ppm lages ved å tilsette 10 ml av bruksløsningen til 90 ml sjøvann. 8 ppm lages ved å tilsette 8 ml av bruksløsningen til 92 ml sjøvann. 6 ppm lages ved å tilsette 6 ml av bruksløsningen i 94 ml sjøvann. 4 ppm lages ved å tilsette 4 ml av bruksløsningen til 96 ml sjøvann. Resultat og diskusjon Den konsentrasjonen som beregnes inaktivere 50 % av lusa (EC50) ved 180 minutters eksponeringstid er 11.5 ppm Aqui-S (PROBIT-analyse). Dette gjelder etter ett døgns avlesning. Resultatet er ikke signifikant. 4

5 Tabellen under viser antall levende, moribunde og døde lus ved 4 ppm Aqui-S: 4 ppm Aqui-S: Levende Moribund Døde Eksponeringstid og avlesningstidspunkt 45 min minutter min min + 1 døgn akklimatisering min + 1 døgn akklimatisering min + 1 døgn akklimatisering Kontroll Kontroll + akklimatisering Tabellen under viser antall levende, moribunde og døde lus ved 6 ppm Aqui-S: 6 ppm Aqui-S: Levende Moribund Døde Eksponeringstid og avlesningstidspunkt 45 min minutter min min + 1 døgn akklimatisering min + 1 døgn akklimatisering min + 1 døgn akklimatisering Kontroll Kontroll + akklimatisering

6 Tabellen under viser antall levende, moribunde og døde lus ved 8 ppm Aqui-S: 8 ppm Aqui-S: Levende Moribund Døde Eksponeringstid og avlesningstidspunkt 45 min minutter min min + 1 døgn akklimatisering min + 1 døgn akklimatisering min + 1 døgn akklimatisering Kontroll Kontroll + akklimatisering Tabellen under viser antall levende, moribunde og døde lus ved 10 ppm Aqui-S: 10 ppm Aqui-S: Levende Moribund Døde Eksponeringstid og avlesningstidspunkt 45 min minutter min min + 1 døgn akklimatisering min + 1 døgn akklimatisering min + 1 døgn akklimatisering Kontroll Kontroll + akklimatisering

7 For å kunne beregne EC50 verdier og øke sannsynligheten for at resultatet blir signifikant anbefales konsentrasjoner av Aqui-S i et intervall fra en konsentrasjon som er så lav at en liten andel av lusa dør til en konsentrasjon som er såpass høy at majoriteten av lusa dør. I bioassayene som rapporteres her døde under halvparten av lusa ved den høyeste konsentrasjon og den lengste holdetiden (180 min). Generelt viste Aqui-S ved ulike fortynninger en tendens til sammenheng mellom dose og respons mht inaktivering av lusa, slik at man kunne ha forventet seg signifikante EC50 verdier dersom man i tillegg hadde brukt en såpass høy konsentrasjon av Aqui-S at flertallet av lus døde. I addendum 2 finnes resultatene etter utregning vha PROBIT-analyse. Under finnes en oppsummering av PROBIT-analysen, der det kun for dag to ved 90 og 180 minutters eksponeringstid var mulig å beregne EC50 verdi (for lav dødelighet blant lusa ved andre eksponeringstider/avlesningstidspunkt). Dag1 45min eksponering: Ingen resultat Dag1 90min eksponering: Ingen resultat Dag1 180min eksponering: Ingen resultat Dag2 45min eksponering: Ingen resultat Dag2 90min eksponering: Resultat (Slope not significantly different from zero). Dag2 180min eksponering: Resultat (Slope not significantly different from zero). 7

8 Addendum 1: Evaluation of the response The response to azamethiphos was evaluated 24 hours after end of exposure. Each louse was inspected individually with a forceps. Lice was classified as live when one of the following criteria was fulfilled: - fast swimming - quick reaction if touched - capable of sucking to the walls of the dish - waging the tail before sucking to the wall Typical characteristics for lice to be categorized as inactivated: - the lice do not move and response to touching with the forceps is slow swimming and in short distances - the tail has 90 degree angle with rest of the body - is not able of sucking to the walls of the dish Note the number of lice in each response category of each exposure group on the evaluation scheme (appendix 2). 8

9 Addendum 2: Statistics and evaluation of sensitivity The response data was analysed by Probit analysis (example: POLO Plus, ( The EC50 (=the concentration that immobilize 50 % of the sea lice (moribund + dead)) was estimated, with slope, intercepts and 95 % confidence limits. None of the results was significant. Addendum 3: Statistical analysis; 90 minutes exposure time, after acclimatization in sea water EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES Version 1.5 AquiS 90min dag2 Proportion Observed Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding Control Chi - Square for Heterogeneity (calculated) = Chi - Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = *************************************************************** * NOTE * * * * Slope not significantly different from zero. * * LC/EC fiducial limits cannot be computed. * *************************************************************** 9

10 EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES Version 1.5 AquiS 90min dag2 Proportion Observed Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding Control Chi - Square for Heterogeneity (calculated) = Chi - Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = *************************************************************** * NOTE * * * * Slope not significantly different from zero. * * LC/EC fiducial limits cannot be computed. * *************************************************************** 10

11 EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES Version 1.5 AquiS 180min dag2 Proportion Observed Responding Predicted Number Number Proportion Adjusted for Proportion Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding Control Chi - Square for Heterogeneity (calculated) = Chi - Square for Heterogeneity (tabular value at 0.05 level) = *************************************************************** * NOTE * * * * Slope not significantly different from zero. * * LC/EC fiducial limits cannot be computed. * *************************************************************** Mu = Sigma = Parameter Estimate Std. Err. 95% Confidence Limits Intercept ( , ) Slope ( , ) Spontaneous ( , ) Response Rate AquiS 180min dag2 11

12 Estimated LC/EC Values and Confidence Limits Exposure 95% Confidence Limits Point Conc. Lower Upper LC/EC LC/EC LC/EC LC/EC LC/EC LC/EC LC/EC LC/EC LC/EC