Diagnostikk ved Nasjonalt referanselaboratorium for medisinsk mykologi. Lonny M. Kløvfjell Fagbioingeniør

Transkript

1 Diagnostikk ved Nasjonalt referanselaboratorium for medisinsk mykologi Lonny M. Kløvfjell Fagbioingeniør Avdeling for mikrobiologi OUS Rikshospitalet hf.no Litt tall/ aktivitet Definisjoner Diagnostikk / metoder Kasus Pasient DISPOSISJON 1

2 Hva er et referanselaboratorium? En institusjon som er tildelt en nasjonal medisinsk mikrobiologisk referansefunksjon, er tillagt ansvar for å utføre eller videreføre undersøkelser vedrørende definerte agens, på vegne av alle andre laboratorier. Referansefunksjoner Samle alle gjærsoppisolater fra blodkultur til NORM (identifikasjon og resistensbestemmelse) Identifisere (verifisere) vanskelige sopp isolater fra andre laber Resistensbestemmelse for laber som ikke utfører dette selv Stammebank 2

3 Hvilke analyser har vi? Identifikasjon av gjærsopp, muggsopp og dermatofytter. Maldi TOF Sekvensering Mikroskopi Selektive medier Vitek2 Påvisning av sopp DNA (PCR). Utføres på molekylær enheten for oss. Langtidsdyrkning mhp sopp Resistensbestemmelse av gjær og muggsopp. Pneumocystis IF Serologi Antigenpåvisning (galaktomannan, utføres på virus). LITT TALL I 2015 mottok vi 203 soppisolater fra blod, hvorav 199 var candida. Candida albicans er hyppigst isolert ved candidemi, 67,8 %. C.glabrata utgjør 16,6 % mens andel av andre candidaarter er lav, C.tropicalis C.dubliniensis og C.parapsillosis er av disse hyppigst forekommende med 3 4 %. Vi får også flere isolater fra andre lokalisasjoner enn blod. I 2015 var det 191 slike gjærsoppisolat og 79 muggsoppisolat. 32 dermatofyttisolater til identifikasjon i

4 Sopp analyser Totalt antall analyser i 2015: 6989 SOPPTYPER GJÆRSOPP MUGGSOPP DIMORFE SOPP DERMATOFYTTER 4

5 Gjærsopp Får tilsendt alle isolater fra blodkultur, samt en del fra andre materialer. Sendes som oftest på pensel. Såes ut på Saboraud og kromskål Identifikasjon: Krom (grønn/ikke grønn) Maldi TOF Andre enkle tester Evt. Vitek Sekvensering Resistensbestemmelse 5

6 Muggsopp Invasive infeksjoner Luftveier Hud Øye Hvis sendt på skål: Rask vurdering av farge og øvrig morfologi Lupe Mikroskopi (bomullsblått, tapeteknikk) Sub på ulike temperaturer (28/37/45/50+ C) Resistensbestemmelse dersom ønsket Maldi TOF ID kommer nå Sekvensering Aspergillus Penicillum Mucorales 6

7 Aspergillus sp 13 A.fumigatus A.flavus A.niger A.terrus 180 species Vel 30 assosiert med human sykdom Aspergillus 7

8 Penicillum Mucorales 8

9 Dermatofytter Tinea pedis fot Tinea unguis (onychomycose) negler (hånd/fot) Tinea corporis kropp (ringorm) Tinea capitis hode (hår/skjegg) 9

10 Trichophyton rubrum Trichophyton mentagrophytes (interdigitale) Microsporum canis Microsporum audouinii Trichophyton soudanense Trichophyton violaceum Identifikasjon av dermatofytter Direkte på prøvematerialet: Dermatofytt PCR Dyrkning og tilsendte isolat: Mikroskopi Kolonimorfologi Veksttemperatur Selektive medier Sekvensering 10

11 Trichophyton sp T.soudanense Reflexive hyfer Microsporum makrokonidier 11

12 Dimorfe sopp Gjærsoppform ved 37C Mugggsoppform 28C Histoplasma Blastomyces Coccidioides Penicillum marneffeii Sjelden i Norge Reiseanamnese! Immunsupprimerte (HIV) P3 lab Histoplasma capsulatum 12

13 Mikroskopi Noe av det viktigste vi gjør Rask og sikker Krever øvelse Oppslagsverk Ulike metoder: CFW direkte på prøvemateriale Bomullsblått Blokkpreparat Nålepreparat Tapeteknikk Lupe Struktur Mikrokonidier Makrokonidier Sporangier («stilk») Forgreninger Vesikkel («hoder») Apophyse («hals») Phialider Fruktlegemer chleistotechia/pycnidia Røtter Størrelse Må alltid sees på sammen med kolonimorfologi og andre egenskaper. veksthastighet temperatur 13

14 Sekvensering + mikroskopi Maldi TOF + mikroskopi 14

15 Mucorales Aspergillus Penicillum CALCOFLUORWHITE Flourescens farging Binder seg til chitin som finnes i celleveggen hos sopp. Direkte på prøvemateriale Rask diagnostikk Kan til en viss grad skille noen typer muggsopp fra hverandre. 15

16 BOMULLSBLÅTT tapeteknikk Lactophenolblått Blank tape Objektglass Dekkglass 16

17 Pneumocystis Immunfluorescens Vi bruker farge fra Biorad (Monofluo P. jirovecii IFA Test Kit) Monoklonal, FITC merket antistoff BAL og Indusert sputum 1. Forbehandler med di thio threitol og PBS 2. Sentrifugerer 3. Bunnfall på objektglass 4. Tørkes 5. Fikseres 6. Farges 7. Mikroskoperes 17

18 Resistensbestemmelse av sopp Etest Flytmetode RPMI skåler Amfotericin B leses av ved 100 % hemming Øvrige midler leses av ved 80 (90) % hemming Amphotericin Fluconazole Voriconazole Caspofungin Anidulafungin Micafungin Itraconazole Posaconazole Flucytosin Isovuconazole Vi bruker brytningspunkter anbefalt av EUCAST Ikke alle sopp har fått brytningspunkter 18

19 Buljongfortynning Gullstandard for resistensbestemmelse EUCAST bruker dette ved utarbeidelse av brytningspunkt. Statens Serum Institut i København utfører buljongfortynning 19

20 Screening for azole resistens hos Aspergillus Serologi Aspergillus antistoff (presipiterende antistoff mot aspergillus) Utføres ved klinisk mistanke om aspergillose og lungeaspergillose. Liten verdi hos pasienter med kraftig nedsatt immunforsvar. Elektroforese. Titrering ved positivt funn. Galaktomannan (utføres hos virus avdelingen) Immunsupprimerte, langvarig nøytropene pasienter. Komponent i celleveggen hos Aspergillus. Enzym immuno assey; EIA teknikk som påviser Aspergillus galactomannan antigen i serum (spinalvæske og BAL). 20

21 Fritekst... fritekst... fritekst Fugleantigen (immundiffusjon): Utføres ved mistanke om allergi mot due, høns eller undulat K P t r 1 r n 4 1 r : 2 1 P 1 r. 3 P r. 3 5 n r : 4 5 n r : 4 Dimorfe sopp (immundiffusjon): Utføres ved mistanke om sykdom/eksposisjon for dimorfe sopp (Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermatitidis, Coccidioides immitis) 21

22 Kryptokokk antigen Ø hjelp Utføres på spinalvæske, serum og BAL Hurtigtest fra IMMY Rimelig, rask og enkel Dermatofytt PCR Hud, hår og negler dyrkes ikke lenger rutinemessig, kun PCR Metoden påviser de vanligste artene: Trichophyton, Microsporum og Epidermophyton Realtime PCR Smeltepunktsanalyse: 22

23 Påvisning av sopp DNA Spesifikke PCR analyser til bruk direkte på prøvematerialet Aspergillus sp og Aspergillus fumigatus DNA Utføres vanligvis parallelt Sterilt materiale BAL hos immunsupprimerte Mucorales DNA Rhizomucor sp Lichtheimia sp (Absidia) Rhizopus sp Pneumocystis jirovecii DNA semikvantitativ Pneumosystis IF på moderat og sterkt positive Påvisning av sopp DNA direkte på prøvematerialet Ulike målgener som er felles for de fleste sopparter ITS2 og D1D2 Der sopp DNA påvises, utføres en sekvensering Gensekvensene sammenlignes med tilsvarende sekvenser i internasjonale databaser for sopp. Arbeidskrevende metode. 23

24 Kasus Leverabscess hos nøytropen pasient etter pseudomonassepsis. Ultralydveiledet leverbiopsi. Leverbiopsi soppmikroskopi calcofluorwhite Mikroskopi: brede, vridde irregulære hyfer uten septa. Tid til farging ca 2 minutter Mucorales 24

25 Leverbiopsi PCR Mucorales PCR: Rhizomucor sp DNA påvist Undersøkelsen tar < 2 timer, settes opp daglig Soppsekvensering direkte på biopsien: Rhizomucor pusillus DNA påvist 3 x pr uke, tid 2 3 dager Mucorales Ømfintlige hyfer Oppvekst kan utebli om prøven mortres eller pasienten står på antimykotika Trenger ofte 37 grader 25

26 Dyrkning mucoreles Rhizomucor pussilus Lokkløfter Viktig med rask mistanke til kliniker Behandling: Kirurgi OG høy dose amfotericin B og med posakonazol Pasienten Gjentatte leverreseksjoner Høydosert liposomalt amfotericin B og posakonasol Frisk 26

27 Mucormykose Disseminert form med affeksjon av flere organer. Risikofaktorer som for Aspergillusinfeksjoner Dessuten Ketoacidose Ukontrollert diabetes mellitus Vorikonazol profylakse eller behandling Mikroskopi av BAL og fra kultur Takk for oppmerksomheten 27