Kompendium i Bioteknologi (TBT4170)

Transkript

1 Kompendium i Bioteknologi (TBT4170) Det følgende er en oppsummering av emnet TBT4170 Bioteknologi på NTNU basert på pensumboka Biotechnology for Beginners av Reinhard Renneberg, og forelesninger. Det ble i utgangspunktet skrevet som en slags ordliste (men det tok litt av), derfor starter mange avsnitt med en kort definisjon/beskrivelse av det som står i overskriften. På slutten av dokumentet ligger det en tonsill (mange dokumenter har appendiks, men man skal ikke glemme at kroppen har da sannelig andre organer som kan skjæres vekk også) med blant annet lenker til videoer og artikler, kildekoden til dette dokumentet, og et register. Sist oppdatert 29. mai Jonathan Reichelt Gjertsen jonath.re@gmail.com Innhold 1 Cellebiologi 1 2 Enzymer 4 3 Genteknologi 6 4 Industriell bioteknologi 8 5 Medisinsk bioteknologi 12 6 Miljøbioteknologi 14 7 Grønn bioteknologi 17 8 Kloning og embryoer 20 9 Medisinsk bioteknologi II Analytisk bioteknologi 23 1 Cellebiologi Dette kapittelet er en innføring i hvordan celler er bygget opp, samt litt om hvordan celler tar opp og bruker energi (metabolisme). 1.1 Celler Celle Den fundamentale enheten for liv. Alle celler er avgrenset fra omgivelsene med en cellemembran, er åpne systemer med metabolisme (de tar opp næringsstoffer fra miljøet, transformerer dem, og slipper ut avfallsstoffer i miljøet), er i stand til å vokse ved å omforme kjemikaler fra miljøet til nye celler, og inneholder gener, og er del av en evolusjonsprosess: endringer i genene videreføres til etterkommere. Noen celler kan bevege seg på egenhånd ved hjelp av spesialiserte strukturer (dette kalles motilitet), kan forandre form og egenskaper i løpet av forskjellige faser i en livssyklus (dette kalles differensiering), kan kommunisere og interagere med andre celler ved hjelp av kjemikalier som tas opp og slippes løs i miljøet, eller kan overføre arvematerialer til og fra andre celler (dette kalles horisontal genetisk utveksling). Katalytiske funksjoner Celler utfører kjemiske reaksjoner som akselereres via enzymer. Dette beskrives i Kapittel 2. De katalytiske funksjonene til en celle fasiliterer cellevekst, og inkluderer lagring av energi i form av ATP, samt dannelse av forløperne til makromolekyler som karbohydrater, aminosyrer og fettsyrer. Genetiske funksjoner Celler lagrer og prosesserer genetisk informasjon, som videreføres til etterkommere gjennom reproduksjon. Denne informasjonen er lagret som DNA. De genetiske funksjonene til en celle fasiliterer reproduksjon. Genetiske funksjoner i cellen inkluderer transkripsjon (produksjon av RNA fra DNA) og translasjon (produksjon av proteiner fra RNA). Prokaryot celle En kategori relativt enkle celler som omfatter bakterier og arkebakterier. Navnet kommer fra det greske karyon (kjerne), og forteller at dette er cellene som fantes før (pro) det fantes organismer med cellekjerne. Det hender at bakterie og prokaryot brukes om hverandre litt upresist, men det går stort sett fint. Alle prokaryoter har en cytoplasmamembran (se eget avsnitt), en nukleoid: sirkulært DNA som inneholder den genetiske koden til organismen, som ikke ligger i en cellekjerne, og ribosomer, som utfører translasjon (lager proteiner fra RNA). De fleste prokaryoter har plasmid er: små, ekstra fragmenter av DNA utenfor nukleoiden, en cellevegg som beskytter cellen mekanisk og kjemisk fra omgivelsene og er et ekstra beskyttende lag, og/eller flagella og pili (strukturer på utsiden av cellen som gjør cellen i stand til å bevege seg på egenhånd og kommunisere med andre celler). 1

2 Eukaryot celle Cellene som planter, dyr og sopper består av. De er større og mer komplekse enn prokaryote celler. De har forskjellige kompartementer som utfører spesifikke metabolske oppgaver og er adskilt fra hverandre med membraner. Alle eukaryoter har en cellekjerne, som inneholder cellens DNA, organisert i form av kromosomer, mitokondrier som genererer energi, en cytoplasmamembran (se under), ribosomer, endoplasmatisk retikulum, et transportnettverk for molekyler som skal til bestemte steder, og et golgiapparat som prosesserer og pakker makromolekyler som syntetiseres av cellen, f.eks proteiner og lipider. Noen eukaryoter har kloroplaster, også kjent som grønnkorn, som utfører fotosyntese, og cellevegg. Cytoplasmamembran Halvgjennomtrengelig membran som omringer cellen, og skiller innholdet i cellen (cytoplasmaet) fra miljøet. Den er 6-8nm tykk. Den består av et dobbeltlag av fosfolipider der de hydrofobe karbonkjedene er vendt mot hverandre og de hydrofile fosfat/glyserol-endene er vendt utover mot miljøet og innover mot cytoplasmaet. Det finnes andre variasjoner over samme tema, der andre kjemiske grupper er bundet til glyserol- ryggraden. Proteiner i cytoplasmamembranen Det finnes proteiner som setter seg fast inne i cellemembranen. Disse kalles membranproteiner. De kan enten stikke ut på en side (perifere membranproteiner) eller på begge (dvs. at de går tvers igjennom - integrale membranproteiner). Dette stabiliseres av hydrogenbindinger. I tillegg kan Mg 2+ og Ca 2+ -ioner stabilisere membranen ved å lage ionebindinger. selv om konsentrasjonsgradienten i miljøet skulle tilsi det motsatte, er et anker for viktige proteiner (som beskrevet over), og spiller en viss rolle i energilagring: det produseres eller brukes energi når ioner passerer cellemembranen, avhengig av om ionet henholdsvis følger konsentrasjonsgradienten eller går motsatt vei av den. Regler for bevegelse gjennom cellemembranen Enkelte små uladde molekyler (som vann) kan passere gjennom passiv diffusjon. Store molekyler og små ladde molekyler kan ikke passere gjennom membranen på passivt vis, men må delvis degraderes før opptak. For eksempel må proteiner degraderes til aminosyrene de består av. Mange typer molekyler kan passere gjennom aktive transportsystemer - disse prosessene er forskjellige fra stoff til stoff, og kan kreve energi ved bruk av ATP. Cellemorfologi Morfologi er læren om form, og celler kan ha forskjellige former. De vanligste celleformene for prokaryoter er coccus (kulerunde eller eggformede), stav (sylindriske) og spirillum (spiralformede). Faktorer som 1.2 Metabolisme kan påvirke cellemorfologi er Metabolisme De livgivende kjemiske reaksjonene som Optimalisering av næringsopptak. Dette favoriserer foregår i celler. Den deles opp i katabolisme og anabolisme. små celler med stort areal per volum, siden næringsopptak skjer ved celleoverflaten. Svømmeevne i tyktflytende medier eller nær overflater. Katabolisme Den delen av metabolismen som bryter Dette favoriserer spiralformede celler. Glideevne. Dette favoriserer tynne bakterier. ned organiske stoffer til enklere stoffer og henter energi gjennom en rekke kjemiske reaksjoner som kalles celleånding. Alle avsnittene mellom dette og Anabolisme omhandler aspekter ved katabolisme. Metabolsk diversitet Forskjellige mikroorganismer har gjennom 4 milliarder år med evolusjon utviklet metoder for å oppta energi fra miljøet på nesten alle tenkelige måter. Figur 1 viser en oversikt over metabolsk diversitet: organismer som bruker lys som energikilde kalles fototroper - dette kan skje ved oksygenisk fotosyntese (produserer oksygen) eller anoksygenisk fotosyntese (produserer ikke oksygen). Andre organismer kalles kjemotrofer og opptar energi ved å oksidere kjemisk drivstoff. Organismer som bruker uorganiske stoffer (H 2 H 2 SFe 2+ NH + 4, etc) som energikilde kalles kjemolitotrofer - kun prokaryoter er kjemolitotrofer. Organismer som bruker organiske stoffer (glukose, acetat, etc.) som energikilde kalles kjemoorganotroper - aerobe organismer bruker oksygen for å ta opp energi og anaerobe organismer opptar energi i fravær av oksygen). Uansett hvordan energien er tatt opp fra miljøet, lagres den som ATP. Membranforsterkere Noen membranforsterkende stoffer er steroler (stive plane lipider som finnes i eukaryoter) og hopanoider (ligner på steroler og finnes i bakterier). Autotrofer og heterotrofer Funksjonene til cytoplasmamembranen Cytoplasmamembranen er en halvtgjennomtrengelig membran som er spesifikk nok til at næringsstoffer kommer inn og avfallsstoffer går ut (ved hjelp av transportproteiner), Alle organismer trenger karbon. Autotrofer får karbonet sitt fra CO 2, og kalles ofte primærprodusenter. Heterotrofer trenger ett eller flere organiske molekyler som kilde for karbon, og får tak i dette enten ved å spise autotrofer eller produkter som produseres av autotrofer, eller ved å spise andre heterotrofer. 2

3 Ekstremofile organismer Organismer som overlever i ekstreme habitater der de har funnet sin egen nisje, for eksempel kokende varme kilder, breer, og vann med ekstremt høy saltkonsentrasjon eller ph. Teknikkene som ekstremofile organismer bruker for å takle slike miljøer, kan være interessante å studere, bruke og forsøke å gjenskape. nukleinsyrer (består av nukleotider, brukes til å lagre, transportere og uttrykke genetisk informasjon), proteiner (består av aminosyrer, brukes til enzymer, som strukturelle komponenter og til transport av molekyler), og lipider (består av glyserol, fettsyrer og i noen tilfeller fosfat, fungerer som membraner (enten cytoplasmamembranen eller intracellulære kompartmenter)). Aerob glukosemetabolisme Aerob glukosemetabolisme er cellens mest effektive metode for å produsere ATP. Det kalles også respirasjon, og involverer den vanlige reaksjonen for celleånding: C 6 H 12 O O 2 38 ADP til ATP 6 CO H 2 O Anaerob glukosemetabolisme og involverer reaksjoner som Kalles fermentering, C 6 H 12 O ADP til ATP 2 C 2 H 5 O CO 2 Figur 1: Klassifisering av organismer, basert på energikilde. Energibærere Energivalutaen i celler er Adenosin trifosfat (ATP). ATP er det som produseres når cellen bryter ned næringsstoffer, og det som brukes når cellen skal gjøre noe som krever energi. Reaksjonen der ATP mister en fosfatgruppe for å bli adenosin difosfat (ADP) slipper løs 32 kj/mol. De samme gjelder ADP AMP. AMP Adenosin slipper løs 14 kj/mol når fosfatadenosin-bindingen kuttes. Ett vannmolekyl inngår i hver slik spaltning. Elektronbærere Energibærere som overfører elektroner: nikotinamid adenin dinukleotid (NAD) og flavin adenin dinukleotid (FAD). Det produseres mye mindre cellemasse gjennom fermentering enn ved respirasjon (kun 5%). Reaksjonen krever mer glukose per ATP som blir produsert, og produserer sideprodukter som etanol. Eksempler på anaerob glukosemetabolisme er gjæring, og er når menneskekroppen danner melkesyre. Gjæring Når konsentrasjonen av O 2 blir lav, endres genuttrykket i gjær slik at det er andre enzymer som aktiveres. I stedet for enzymene som utfører aerob metabolisme, aktiveres enzymene som utfører anaerob metabolisme. Dette er prinsippet bak gjøring. Metabolsk spor Et metabolsk spor er en tegning av veien fra næringsstoff til produkt, med piler mellom mellomprodukter. Skissering av metabolske spor med glukose som utgangspunkt sies å være veldig eksamensrelevant. Langtidslagring av energi Gjøres ved å lagre stoffer som uløselige polymerer som kan oksideres for å generere ATP. Noen eksempler er glykogen, polyhydroksyalkanoater Glukosemetabolisme og svovel i prokaryoter; og stivelse og fettsyrer i eukaryoter. Anabolisme Den delen av metabolismen som lager cellens byggestoffer fra enklere stoffer gjennom energikrevende reaksjoner. Cellens byggestoffer er karbohydrater (består av monosakkarider som glukose og fungerer som energilager samt en komponent i cellevegger), Figur 2 er en omformulering av figuren på slides, og kan med fordel pugges siden detaljer herfra har vært eksamensoppgaver. Det er naturligvis en del forenklinger her, blant annet forklares det ikke hvor man får vann fra. Man blir ikke så fryktelig klok på hvorfor glukosemetabolisme er relevant for resten av stoffet ved å se på denne figuren. Det blir man derimot ved å se på den utvidede figuren i Box 1.4 i Renneberg; når du er ferdig med å lese hele pensum kan du stirre lenge og vel på den figuren, og innse at nesten alle bioproduktene som har blitt diskutert til syvende og sist stammer fra nedbrytning av glukose. 3

4 når H fra en aminogruppe og OH fra en karboksylsyregruppe går ut som et vannmolekyl, og legger igjen en binding som ser slik ut: Figur 2: Oversikt over glukosemetabolismen På grunn av resonans i peptidbindingen (i resonansstrukturen som ikke er vist i figuren, blir C O-bindingen til en C O -binding, mens C N-bindingen blir til en C N + - binding) kan ikke molekylet rotere rundt en peptidbinding, og alle atomene som inngår i en peptidbinding (C, O, N, H) ligger i samme plan. 2 Enzymer Dette kapittelet forklarer hva proteiner er laget av og hvordan de er bygd opp. Så går vi nærmere på enzymer og hvordan de fungerer. Mot slutten også noen eksempler på enzymer, enzymkatalyserte reaksjoner og bioteknologiske løsninger som tar i bruk enzymer. 2.1 Proteiner D- og L-stereoisomeri En type stereoisomeri for aminosyrer, som fungerer som følger: hvis man lar hydrogenatomet gå inn i arket, har man L-formen hvis gruppene som går mot klokka er COOH R NH 2, og D-formen hvis man får denne rekkefølgen ved å gå med klokka. Peptider Korte kjeder av aminosyrer kalles peptider og navngis ved å begynne på den terminale aminogruppen, traversere peptidet til man støter på den terminale karboksylsyregruppen, og ramse opp alle aminosyrene på veien. Fullstendig navngivning av proteiner er dermed upraktisk, men det som er så fint er at det finnes altså en russisk fyr som har uttalt hele det fullstendige systematiske navnet til verdens lengste protein (titin). Det tok så lang tid at man kunne se forskjellen i skjeggvekst på starten og slutten av opptaket. Primærstrukturen til proteiner er sekvensen av aminosyrer, samt eventuelle disulfidbindinger mellom cysteingrupper. Primærstrukturen gir opphav til sekundær- og tertiærstruktur (men du blir ikke akkurat så mye klokere på høyere ordens struktur ved å se på aminosyresekvensen). Aminosyrer Karbon bundet til et hydrogenatom, en karboksylsyregruppe og en aminogruppe, samt en såkalt R-gruppe som kan være mye rart (upolar alifatisk som i glysin, aromatisk som i fenylalanin, polar uladd som i serin, positivt ladd som i lysin, negativt ladd som i aspartat). 9 av de 20 aminosyrene som brukes i proteinsyntese er essensielle aminosyrer som må opptas gjennom mat. Sekundærstrukturen til proteiner er lokale strukturer i proteinet. Det er bare to slike strukturer vi snakker noe særlig om: α-helikser og β-flak. α-heliks Proteinet kan kveile seg i en spiral, som kan være venstre- eller høyrehendt. Denne strukturen stabiliseres av hydrogenbindinger langs spiralens akse. I en slik spiral kan man for eksempel ha at en side er hydrofob, mens den andre er hydrofil. β-flak Flak som dannes når rette tråder av proteinet bretter seg frem og tilbake, med hydrogenbindinger mellom trådene. Hvis trådene går i samme retning, er flaket parallelt, og hvis de går i alternerende retninger er flaket Av en eller annen grunn finnes kun L-enantiomerene antiparallelt. β-flak er foldet i trekkspill-mønster, og til aminosyrene i proteiner. D-aminosyrer finnes andre R-gruppene på aminosyrene vil stå ut av flaket. steder i naturen, der de fungerer som mellomtrinn i aminosyremetabolisme, i polypeptider i celleveggene til Tertiærstrukturen til proteiner er den tredimensjonale strukturen som reflekterer proteinets funksjon. Slik noen bakterier, og som nevrotransmittere (signalstoffer). Det har også blitt syntetisert proteiner av D-enantiomerer struktur er stabilisert av hydrofobe interaksjoner med vann i laboratoriet - disse vil være speilbilder av proteinene som (hydrofobiske grupper vender seg mot midten av proteinet dannes fra L-enantiomerene. og hydrofile grupper vender seg utover) samt hydrogenbindinger og ioniske interaksjoner som optimaliseres i de Peptidbinding Aminosyrer bindes sammen via peptidbindinger mest termodynamisk stabile strukturene. Disse interaksjonene i lange polymerer som vi kaller proteiner. En peptidbinding dannes gjennom en kondensasjonsreaksjon gjør at proteiner har en tendens til å krølle seg sammen til den karakteristiske klumpete formen. 4

5 Kvartærstrukturen til proteiner I noen tilfeller er det flere proteiner, eller flere molekyler av det samme proteinet, som går sammen for å danne en større struktur. Denne strukturen kalles da kvartærstrukturen til proteinet. Et eksempel på et protein med kvartærstruktur er hemoglobin, der 4 polypeptidkjeder går sammen for å danne én funksjonell enhet. gjør at enzymet lokalt ligner på en organisk (upolar) løsning. Dermed blir de få polare gruppene i nærheten svært reaktive i forhold til det de ville vært i vandig løsning. Kofaktorer Kjemiske stoffer som ikke er proteiner, og som et enzym krever for å utføre oppgaven sin. Typisk inorganiske molekyler som Fe 3+, Mg 2+, Mn 2+ og Zn Enzymer Enzym Biologisk katalysator som får reaksjonene i cellen til å gå raskere ved å senke aktiveringsenergien til reaksjonene. Struktur til enzymer De fleste enzymer er proteiner. Det finnes også enzymer som består helt eller delvis av RNA, disse kalles ribozymer. Proteiner er bygget opp av aminosyrer som er kovalent bundet til hverandre i lange kjeder. Et område på en enzym der det foregår en reaksjon kalles et aktivt sete. Substrat Enzymer er gjerne veldig spesifikke, i så stor grad at proteinet har en fysisk form der molekylet som skal prosesseres (dette molekylet kalles substratet) passer inn. Nøkkel-i-lås Dette var den første hypotesen om samspillet mellom enzymet og substratet: at substratet passer perfekt inn i enzymet fordi enzymet er en romlig negativ av substratet. En slik hypotese forklarer hvordan enzymer kan være så spesifikke. Hånd-i-hanske Det har vist seg at substratet fungerer mer som en hånd i en handske, fordi substratet og enzymet kan påvirke hverandre underveis i reaksjonen. Enzymet og substratet er altså litt mer fysisk fleksible enn nøkkel-i-låsanalogien skulle tilsi. Lysozym er det første proteinet som ble analysert ned til den minste atomære detalj. Lysozym hydrolyserer bindingen mellom sukkerring 4 og 5 i et molekyl som består av 6 sukkerringer. Glukoseoksidase Dette proteinet omformer β D- glukose, men ingen andre sukkerarter eller karbohydrater, til glukonolaton. Dette er fordi det kun er β D-glukose som er lite nok og passer akkurat inn i den romlige strukturen til glukoseoksidase. Glukoseoksidase er med andre ord svært substratspesifikt enzym. Mulige årsaker til reduksjon i aktiveringsenergi Enzymer kan redusere aktiveringsenergien til en reaksjon. Enzymet binder seg ikke til substratet i sin opprinnelige konfigurasjon, men til en mellomtilstand som kan være deformert i forhold til det originale stoffet. Inne i enzymet er svært reaktive funksjonelle grupper konsentrert på et veldig lite område, og satt sammen på en måte som gjør at de er i direkte kontakt med bindingene i substratet som skal modifiseres. Området rundt det aktive setet består stort sett av upolare grupper, som Koenzymer Organiske forbindelser som binder seg til eller i nærheten av det aktive setet. De modifiserer strukturen til substratet eller beveger elektroner, protoner eller kjemiske grupper mellom substratet og enzymet. I motsetning til enzymene selv brukes koenzymer opp i enzymkatalyserte reaksjoner. Mange av disse kommer fra vitaminer, for eksempel NAD + fra vitamin B. Klassifisering av enzymer Det finnes seks typer enzymer, som navngis etter hva de gjør: oksidoreduktaser reduserer ett stoff og oksiderer et annet, transferaser overfører kjemiske grupper fra et stoff til et annet (gjerne ved hjelp av koenzymer), hydrolaser kløyver stoffer med addisjon av vann, lyaser kløyver stoffer uten addisjon av vann (og danner gjerne dobbeltbindinger eller ringstrukturer), isomeraser omdanner et molekyl til en annen isomer, og ligaser bruker ATP for å binde sammen to stoffer. Eksempler på enzymer og enzymkatalyserte reaksjoner Ekstracellulære hydrolaser produseres av mikrober og slippes ut i miljøet for å degraderer biopolymerer til mindre enheter som kan tas opp av mikroben. De brukes også av edderkopper til såkalt ekstraintestinal fordøyelse. Ekstracellulære hydrolaser er av naturlige grunner de enzymene som er enklest og billigst å ekstrahere fra en cellekultur - det er ikke noen cellemembran mellom deg og enzymet. De fire neste eksemplene er ekstracellulære hydrolaser. Malt inneholder amylaser, som bryter opp stivelse til kortere oligosakkarider, samt glucoamylase, som bryter opp oligosakkarider til glukose. Disse enzymene kan brukes i baking for å bryte ned stivelse til sukker og dermed akselerere heving, samt for å degradere klebrig gluten og gjøre deigen luftigere. I tekstilindustrien tilsetter man gjerne stivelse for å få fibrene til å holde seg sammen under veving. Amylaser brukes til å fjerne stivelse når vevingen er ferdig. Pektinaser bryter ned de store pektinmolekylene i frukt for å gjøre juicen mindre tyktflytende. Hvis man ikke fjerner pektin, får juicen en gel-aktig konsistens som er uønsket og vanskelig å håndtere. Pektinaser hentes fra Aspergillus- og Rhizopus-sopp. Papaya, fiken og ananas inneholder proteaser som bryter ned bindevev i kjøtt, og dermed gjør det mørere. De samme enzymene brukes også for å mykne lær. Hydrolaser med lav substratspesifisitet: brukes som vaskemidler som bryter ned fett og proteiner, som 5

6 binder seg til fibrene i tøy. Fett og proteiner er limet som gjør at skitt setter seg fast i klær. Enzymer er nyttige fordi de gjør at man kan gjøre oppvasken på relativt lav temperatur. Før i tida måtte slike enzymer hentes ut fra bukspyttkjertler til dyr, men etter at enzymet subtilisin ble oppdaget i Bacillus licheniformis på 60-tallet, inneholder vaskemiddel som regel hydrolytiske enzymer fra mikroorganismer. Andre enzymer som brukes i vaskemiddel er cellulaser, som bryter ned mikrofibre i bomull og gjør stoffet mer mykt, og amylaser og lipaser som fjerner matrester i vaskemaskiner. Fosfor i planter lagres gjerne i form av fytat, en seksringet forbindelse. Mennesker og dyr klarer ikke å ta opp fosfor i denne formen, men det finnes mikrobiell fytase som hydrolytisk kløyver fytat slik at man ender opp med fosfat, som vi kan ta opp. Fytaser er et spesielt nyttig tilskudd i grisefôr, fordi man slipper å tilsette så mye miljøskadelig fosfat (kapittel 6) i fôret. Glukoseisomerase: brukes til å omdanne glukose til fruktose, som er søtere enn glukose (og sukrose). 3 Genteknologi eukaryote celler er DNA lagret i cellekjernen, samt i mitokondrier og kloroplaster, som har eget DNA (da disse organellene opprinnelig var bakterier med eget arvemateriale). Grunnenheten som DNA består av er en nukleotid: en base (adenin(a), guanin(g), cytosin(c) eller tymin(t)/uracil(u) (sistnevnte er henholdsvis for DNA og RNA)) bundet til et molekyl av sukkeret deoksyribose (eller ribose, i RNA), som så er bundet til en fosfatgruppe. Sammensetning Nukleotidene er bundet til hverandre gjennom fosfodiesterbindinger for å danne en polynukleotidkjede. Vi sier at kjeden har en retning, 5 3, fordi 5 -hydroksygruppen på ett nukleotid er bundet til 3 hydroksygruppen på et annet nukleotid via en fosfatgruppe. Per konvensjon begynner vi på ende-fosfatgruppen som er bundet til en 5 -hydroksygruppe. Dobbeltstrengen i DNA i DNA er hver nukleotid i en polynukleotidkjede bundet til en tilsvarende nukleotid i en annen polynukleotidkjede etter regelen A T, G C. Denne baseparringen skjer på grunn av hydrogenbindinger mellom basene: adenin og tymin danner to hydrogenbindinger seg imellom, guanin og cytosin danner tre hydrogenbindinger seg imellom. Dette holder DNA, som altså egentlig er to molekyler (polynukleotidkjeder), Immobiliserte enzymer Enzymer som på en eller annen måte sitter fast i et medium. Metoder for å immobilisere enzymer inkluderer adsorbsjon til fibre, kovalente sammen som om det var ett molekyl. Derfor kommer bindinger til fibre, krysslinking mellom enzymer, immobilisering i gel eller hule fibre og mikrokapsler. Det som er fint med immobiliserte enzymer, er at de kan utføre reaksjoner under kontrollerte betingelser uten å det noe ukorrekte begrepet DNA-molekyl til å bli brukt videre i teksten. De to strengene i DNA er antiparallelle - 3 -enden på en streng korresponderer til 5 -enden på en annen streng. legge igjen enzymrester i produktet (nyttig for å forhindre immunreaksjoner i pasienter). Samtidig blir mindre av Replikasjon av DNA At DNA tar form som en dobbeltstreng, gir opphav til en mekanisme for å kopiere et DNA- enzymet kastet bort; enzymet er resirkulerbart. molekyl. De to strengene separeres, og en ny streng settes sammen ved å bruke nukleotider etter regelen for baseparing. Dermed pares hver av strengene i DNA opp med en nylig syntetisert komplementær streng, og da har man to DNA-molekyler. Enzymene som utfører denne operasjonen heter DNA polymerase. Enzymkilder Hvis vi vil ha tak i enzymer til eget bruk, har vi forskjellige kilder. Av det som ikke er nevnt tidligere: Bukspyttkjertler, spesielt til gris, inneholder mye fint: trypsin, chymotrypsin, lipaser og amylaser. Magesekker inneholder pepsin. En av de nyttigste enzymkildene er mikroorganismer, som er veldig greie å ha med å gjøre og kan gros på laben og i reaktorer - og via genteknologi kan enzymene skreddersys. Det finnes også mange bruksområder Strukturen til RNA for enzymene som dannes av ekstremofile mikroorganismer, for eksempel DNA polymerase, som vi skal se blir nyttig i analytisk bioteknologi (kapittel 10). RNA ligner mye på DNA, med følgende forskjeller: der det er deoksyribose i DNA er det ribose i RNA der det er tymin i DNA er det uracil i RNA RNA består av én streng i stedet for to RNA kan ha intrikate sekundærstrukturer, som gjør at det også kan danne enzymer. Ribosomer, for eksempel, er komplekser av protein og RNA. Dette kapittelet Del 1 forklarer strukturen til organismers arvemateriale, og hvordan kroppen bruker DNA til å lage proteiner. Del 2 forklarer hvordan man kunstig kan modifisere arvematerialet med genteknologi. Del 3 tar for seg historien til kunstig fremstilt insulin, som tar opp en del plass i boka. 3.1 Strukturen til DNA og RNA Byggecellene i DNA og RNA DNA er molekylet som inneholder den genetiske informasjonen til organismer. I Proteinsyntese Proteiner dannes som vist i Figur 3. mrna (messenger-rna) syntetiseres fra DNA-et (transkripsjon), som inneholder informasjonen som skal til for at et ribosom kan sette sammen det riktige proteinet (translasjon). Under translasjon er det grupper på tre baser, som kalles kodoner, som bestemmer hvilken aminosyre som skal settes inn i polypeptidkjeden. At informasjonsflyten er DNA RNA protein, og ikke motsatt, kalles det sentrale dogmet i molekylærbiologi. Likevel kan noen virus syntetisere DNA fra en RNA-mal gjennom reverstranskripsjon (kapittel 5). 6

7 Figur 3: Genetisk informasjonsflyt i cellen. En noenlunde nøyaktig beskrivelse av veien fra DNA til protein (med korrekte molekylmodeller) finnes her: Genmodifisering OBS! Teknikkene som diskuteres i dette delkapittelet er ekstremt viktige, og dukker opp igjen og igjen i senere kapitler. Særlig bruken av restriksjons-endonukleaser og plasmider er fundamentale verktøy. Plasmider Små ring-formede biter av DNA som finnes utenfor den mye større DNA-kjeden til bakteriene. En celle har ofte små og 1-2 store plasmider, og de fleste kan reprodusere i cellen uavhengig av hoved-dnaet. De store plasmidene kan utveksles mellom bakterier i en prosess som kalles konjugering. Kloning av gener med plasmider Konjugering kan utnyttes til å klone gener: ved å klippe opp DNA med et gen man ønsker å kopiere, samtidig som man kløyver et plasmid, og så prøver å smugle inn det ønskede genet i plasmidet med ligaser, vil det modifiserte plasmidet spre seg i bakteriekolonien slik at man etter hvert har en bakteriekoloni full av bakterier med det ønskede genet (inni et plasmid). Restriksjons-endonukleaser Klippingen som ble beskrevet over, gjøres med restriksjons-endonukleaser - molekylære sakser. Restriksjons-endonukleasene er hentet fra bakterier som bruker enzymet som en forsvarsmekanisme til å klippe opp virus-dna. Det er mer enn 1200 kjente restriksjonsendonukleaser, og hver av dem er svært spesifikke (de kutter ved bestemte sekvenser på en bestemt måte). Enzymet lager et skjevt kutt slik at det er klebrige ender med enkelt-streng-dna på hver side av kuttet. Se figur i Renneberg om akkurat hvordan dette kuttet er. Dette gjør at andre DNA-fragmenter med like ender kan hektes på (med andre enzymer som kalles Strukturen til et gen Strukturelle gener inneholder informasjonen som skal til for å kode enkeltproteiner, for eksempel enzymer. Ved siden av de strukturelle genene er det sekvenser som kontrollerer om genet skal uttrykkes (det vil DNA-ligaser). Ved å kombinere forskjellige restriksjonsendonukleaser si om det faktisk skal dannes proteiner basert på informasjonen som ligger i genet). En slik sekvens - en start-sekvens (promoter) - en kort sekvens som enzymet RNA-polymerase som danner DNA-fragmenter som passer sammen på riktig måte, kan man altså overføre gener fra ett sted til et annet. kan binde seg til, før det vandrer langs DNA-kjeden og syntetiserer RNA fra og med start-sekvensen. Etter hvert Introner For å klone et eukaryot gen kan man ikke akkurat kutte opp DNA-et, fordi det er fullt av ikke-kodende møter RNA-polymerase på en stopp-sekvens (terminator) som avslutter transkripsjonen. Mellom promoteren og det sekvenser (introner). I RNA danner slike introner sløyfer strukturelle genet finnes det ofte en operator-region der et som kuttes av før det dannes proteiner av RNA-et, så intronene har ikke noen effekt på hvordan genet uttrykkes, repressorprotein kan sette seg fast og forhindre at genet blir uttrykt. En inducer kan binde seg til dette proteinet på men det fører til kaos når man prøver å klone genet med en slik måte at proteinet endrer form og forlater operatorregionen. Et eksempel på en slik inducer er sukker, som restriksjons-endonukleaser. kan binde seg til repressorproteiner for gener for sukkernedbrytende enzymer. Dermed kan forskjellige gener uttrykkes Kloning av eukaryote gener Derfor trenger man heller såkalt voksent mrna der de ovennevnte sløyfene avhengig av hvilke stoffer som befinner seg i organismen. har blitt kuttet av. Ved å bruke et enzym fra virus, revers transkriptase, kan man danne DNA fra slikt mrna. Det Rekombinasjon Utveksling av genetisk materiale mellom resulterende kopi-dnaet (cdna) kan så inkorporeres i to DNA-molekyler. Sammen med mutasjon er rekom- binasjon den viktigste mekanismen som fører til genetisk variasjon. Det er mekanismen som gjør at et barn har DNA som er en blanding av DNA-et til foreldrene. Det er også en mekanisme som virus bruker for å injisere arvematerialet et plasmid på samme måte som beskrevet over, og proteinet man ønsker kan syntetiseres i bakterielle celler. Hvis riktig mrna ikke er tilgjengelig er det også mulig å syntetisere akkurat de nukleotidsekvensene man vil med en DNA-synthesizer (keyboard selges separat). sitt i vertens DNA (kapittel 5). Hybridisering Man har en DNA-probe som består av en enkeltstreng med den komplementære sekvensen til den sekvensen man vet at man ønsker. Den kan for eksempel lages med en DNA-synthesizer. Proben markeres med et radioaktivt eller selvlysende molekylært flagg. Proben legges til en bakteriekultur der man har ødelagt cellemembranene med vaskemiddel og spaltet dobbeltheliksen med natronlut, slik at man har en masse enkeltstrenger. Proben vil kun pare opp med sekvensen man ønsker seg, som resulterer i et hybridisert DNA av typen man ønsker seg. Så vasker man ut probene som ikke har bundet seg til noe. Hvis man har selvlysende flagg kan man enkelt identifisere en del av en bakteriekoloni som har rekombinant DNA ved å lyse på den med røntgenstråler og se på den i et mørkt rom. 7

8 Affinitetskromatografi En form for kromatografi der man utnytter at forskjellige stoffer binder seg forskjellig til spesifikke antistoffer (kapittel 5). Dette kan brukes for å foredle rekombinante proteiner man har laget fra resten av proteinene i bakterieekstraktet. For eksempel binder insulin seg mer til insulin-antistoffer enn andre proteiner gjør. Ved å la bakterieekstraktet renne gjennom en kolonne med slike insulin-antistoffer, vil kun insulinet sette seg fast i antistoffet og forbli i kolonnen. Deretter løser man opp antistoff-insulin-bindingen med en spesifikk svak syre, slik at man ender opp med en løsning insulin er det eneste proteinet. 3.3 Kunstig fremstilt insulin og ender opp med griseinsulin der alanin er erstattet med treonin, det vil si menneskelig insulin. Rekombinant insulin fra E. coli Insulin består av 2 separate kjeder som er bundet til hverandre med disulfidbindinger. Disse to kjedene kommer fra det samme proteinet, som har blitt spaltet i to i bukspyttkjertelen. Bakterier og gjær har ikke evnen til å gjøre dette, så direkte syntese av insulin med rekombinante plasmider er ikke mulig. For å syntetisere insulin med bakterier gror man heller to kjedene separat og setter dem sammen etterpå. På grunn av Frederick Sangers arbeid med DNA-sekvensering (kapittel 10) er basesekvensen i genet for DNA kjent, så ved å manuelt syntetisere de riktige oligonukleotidene for de to kjedene, og sette det inn i plasmid-dna, kan man syntetisere de riktige kjedene. Ved Asilomar-konferansen i 1975 diskuterte noen forskere mulige risikoer ved genteknologi. For eksempel: hva om man kunne lage antibiotikaresistente karsinogene tarmbakterier og forårsake en kreft-epidemi? Eller hva om man fikk bakterier til å produsere aktivt insulin, og de ved et uhell kom seg inn i mennesker og overlevde der? Det ville forårsaket insulinsjokk. Disse hypotetiske situasjonene ble blåst opp til skremmehistorier i mediene, og National Institute of Health satt ned strenge retningslinjer for genteknologi. En konsekvens av dette var at de to kjedene i insulin måtte gros separat i forskjellige bakteriekulturer. Genmodifisering av eukaryote celler Genmodifisering av eukaryote celler er mye mer komplisert enn det tilsvarende for prokaryote celler, fordi genmaterialet er pakket inn som kromosomer i en cellekjerne. Genet man ønsker å introdusere må injiseres inn i DNAet via en eller annen vektor (gjerne et bakterielt plasmid med et antibiotikaresistens-gen, av grunner som blir åpenbare senere i avsnittet), men man må også sørge for at genet faktisk uttrykkes i cellen. DNA-genet man ønsker å introdusere, introduseres til plasmidet med kloningsmetodene som er beskrevet over (restriksjonsendonukleaser og ligaser). Samtidig må en startsekvens/promoter legges inn rett før genet, slik at man i sluttproduktet får et gen som faktisk blir uttrykt. Så lar man dette plasmidet forplante seg gjennom en bakteriekoloni i en løsning med et antibiotikum. Kun bakterier med det ønskelige plasmidet vil ha resistansgenet som gjør at de kan vokse og replisere på Menneskeskapte insulinvarianter tross av antibiotikumet. Når man så har massevis av det rekombinante plasmidet, kan det introduseres i den eukaryote cellen på forskjellige måter: enten ved mikroinjeksjon (fysisk injisere plasmidet med en veldig tynn nål, rett inn i cellekjernen, slik at plasmidet, om man er heldig, blir en del av kromosom-dnaet) eller fagocytose (at man på et eller annet vis utnytter cellens egne mekanismer som den bruker for å spise opp partikler). Deretter gror man de eukaryote cellene i et selektivt medium som kun lar cellene med rekombinant DNA overleve. Det har blitt produsert varianter av insulin som ikke eksisterer i naturen, og som har litt andre egenskaper enn vanlig insulin. Et vanlig problem med insulin er at det når blodomløpet for sakte: høye konsentrasjoner av insulin danner heksamerer, men insulin kommer ikke inn i blodomløpet med mindre det er i form av dimerer eller monomerer. Dermed blir insulinnivået for lavt i begynnelsen, og etter hvert som insulinet brytes opp i mindre komponenter, holder nivået seg for høyt for lenge. Derfor har man produsert insulin der man har byttet plass på prolin og lysin på plass 28 og 29. Denne typen insulin fungerer raskere enn naturlig insulin. Andre varianter som fungerer enda tregere enn vanlig insulin, som varer i opp til 24 timer, forskes det også på. I slike trege varianter har man forlenget én av kjedene for å danne insulin som danner enda mindre løselige heksamerer. Konvertering av griseinsulin til menneskelig insulin Insulin til behandling av diabetes ble i begynnelsen tatt ut fra bukspyttkjertelen til ku og gris. Slikt insulin er ikke helt likt vårt - griseinsulin er forskjellig i en av aminosyrene på enden: de har alanin der mennesker har treonin - og dette fører til bivirkninger og immunreaksjoner fordi immunsystemet kjenner igjen dyreinsulinet som forskjellig fra dens eget insulin. 4 Industriell bioteknologi En metode for å konvertere den terminale aminosyra Dette kapittelet Del 1 beskriver hvordan celler responderer i griseinsulin til treonin ble funnet på 80-tallet. Det viser seg at trypsin, et proteinnedbrytende enzym i magesekken, spesifikt hydrolyserer proteiner og peptider ved siden av aminosyrene lysin og arginin. I griseinsulin er alaninet man på endringer i omgivelsene. Del 2 forklarer metoder vi har for å få cellene til å lage kjemikalier vi ønsker oss. Del 3 er eksempler på industrielle produkter. Det siste eksempelet, antibiotika, er stort nok til å få sin egen del. ønsker å konvertere rett ved siden av lysin, og dermed kan alaninet kløyves av insulinet ved å tilsette trypsin. Samtidig behandler man insulinet med en treonin-tertbutylester 4.1 Adaptasjon i organisk løsning, slik at treonin setter seg der alaninet var. Taktisk og strategisk adaptasjon Vi skiller mellom Til slutt tilsetter man vann for å kløyve av tert-butanol, to kategorier av mekanismer som celler har for å tilpasse 8

9 seg endringer i miljøet. Kort og godt er forskjellen mellom dem at: Taktisk adaptasjon er endring i enzymaktivitet: miljøet påvirker hvordan og i hvor stor grad et enzym fungerer. Taktisk adaptasjon går raskt, gjerne i løpet av noen sekunder. Strategisk adaptasjon er endring i genuttrykk: miljøet påvirker hvorvidt genet for et enzym uttrykkes. Strategisk adaptajon går tregt, gjerne i løpet av timer eller dager. Taktisk adaptasjon Når cellen regulerer metabolismen ved å bruke enzymene som er tilgjengelig for å utføre reaksjonene som kreves der og da. Et eksempel på taktisk adaptasjon er hvis produktet av en enzymdrevet reaksjon forhindrer enzymets funksjon, slik at konsentrasjonen av produktet kontrolleres ved negativ feedback. glukose til et medium der eneste sukkerart er laktose, vil slutte å vokse (fordi de ikke har enzymene som kreves for å bryte ned laktose) i 20 minutter, før de begynner å vokse igjen (fordi de nå har klart å lage disse enzymene). Fenomenet, som kalles induksjon, skjer fordi laktose er en inducer (kapittel 3, Strukturen til et gen ) som binder seg til repressorproteinet som sitter på genet for laktosenedbrytende enzymer. Repressorproteinet endrer form slik at det ikke lenger sitter fast på DNA-et, og kan ikke lenger blokkere RNA polymerase fra å transkribere genene for laktosenedbrytende proteiner. Et tilsvarende eksempel er gjær, som beskrevet mot slutten av kapittel 1. Å motvirke endringer i miljøet ved å midlertidig hemme hemmingen av syntesen av et enzym kalles, noe forvirrende, negativ kontroll, og må for all del ikke forveksles med negativ feedback. Strategisk adaptasjon lar cellen bruke ressursene sine effektivt - for en bakterie ville det vært uøkonomisk å til enhver tid produsere alle enzymene den noensinne trenger, og for en høyere organisme er strategisk adaptasjon en absolutt nødvendighet (det hadde jo ikke vært så fint hvis nerveceller drev og produsere magesyre-enzymer). Allosteriske enzymer Proteiner som i tillegg til det aktive setet har et allosterisk sete med høy affinitet for bestemte små molekyler. Når slike molekyler er tilstede, forandrer de formen til proteinet slik at virkemåten forandres Konstitutive enzymer Essensielle metabolske enzymer (det vil si at proteinet aktiveres eller deaktiveres). Det allosteriske setet trenger ikke å ligne på det aktive setet, så som alltid er til stede og produseres med en omtrentlig konstant rate. aktiviteten til allosteriske enzymer kan påvirkes av stoffer som ikke på noen måte ligner på substratet eller produktet Induserbare enzymer Enzymer som kun produseres til enzymet. Allosteriske enzymer representerer en type når de trengs. Ellers er det repressorproteiner til stede som taktisk adaptasjon i celler. forhindrer at genet for det induserbare enzymet uttrykkes. Samtidig er mange enzymer laget av flere underenheter, der alle inneholder et aktivt sete og minst ett allosterisk sete. Disse enhetene er så tett bundet sammen at kjemisk binding på ett allosterisk sete vil forandre den romlige strukturen 4.2 Industriell bioteknologi til både den gjeldende enheten og de andre enhetene. Industriell bioteknologi Bioteknologi som brukes i in- Denne koblingen mellom underenheter gjør det mulig å dustrielle prosesser. Også kjent som hvit bioteknologi. forsterke responsen på de hemmende eller aktiverende signalstoffene (altså stoffene som binder seg til de allosteriske Black box model Den enkleste matematiske modellen setene) som organismen tar opp. Slike allosteriske enzymer av cellevekst, der alle cellereaksjoner grupperes sammen fungerer som regulatorer i organismen, og har en viktig i én enkelt reaksjon, og cellen ses på som en svart boks rolle flere steder i den metabolske prosessen. der man ikke bryr seg om mekanismene for reaksjonen. For eksempel kan ett enkelt allosterisk pacemaker - En energikilde, en karbonkilde, en elektronakseptor og nitrogen går inn (energikilde og karbonkilde er som regel, enzym i begynnelsen av prosessen bestemme takten på hele metabolismen. Et eksempel på dette er syntesen av men ikke alltid, den samme); cellen transformerer reaktantene; og biomasse, CO 2, vann og et metabolsk produkt glutamin i bakterier: når sluttproduktet akkumulerer i cellen, trigger det en negativ feedack-mekanisme. Vi skal kommer ut. Med denne modellen kan de 6 hovedtypene se i senere eksempler at negativ feedback i mikrober blir et cellemetabolisme illustreres som i figur 4, hvor vi har henholdsvis problem når vi ønsker å bruke organismene til å produsere kjemikalier for oss. 1. Fullstendig oksidasjon. 2. Aerob cellevekst. Forholdet mellom karbon, hydrogen, Strategisk adaptasjon Alle celler i en organisme inneholder nitrogen og oksygen i biomassen er 10:18:2:5. den komplette genetiske informasjonen til organismen i DNA-et, men spesialiserte celler i høyere organismer trenger ikke å uttrykke alle genene i DNA-et. Derfor er mye av den genetiske informasjonen undertrykt, avhengig 3. Aerob cellevekst med produktdannelse. Eksempel på produkt er glutamat. 4. Anaerob cellevekst med produktdannelse. Eksempel på elektronakseptor er NO 3, eksempel på redusert av celletype. Strategisk adaptasjon er cellens metoder elektronakseptor er NO 2. for å uttrykke de genene det er ønskelig å uttrykke, og undertrykke resten av genene. Også enkle organismer har strategisk adaptasjon. Enkelte bakterier, når de flyttes fra et vekstmedium med 5. Fermentering: metabolisme i mangel av både oksygen og en elektronakseptor. Gir minimal cellevekst. Forskjellene mellom aerob metabolisme og fermentering ble beskrevet i kapittel 1. 9

10 6. Crabtree-effekten (i gjær). Skjer når det er såpass overskudd av glukose at cellen må produsere etanol for å unngå intracellulær akkumulering av metabolitter. Utbytte kan oppgis som gram biomasse pr. gram substrat; gram produkt pr. gram substrat; eller teoretisk maksutbytte, maks gram produkt pr. gram substrat. Utvikling av bioprosesser Den tradisjonelle måten å utvikle organismer som produserer et kjemikalium man ønsker seg, kalles klassisk mutagenese ( classical mutagenesis ) og består av følgende trinn: 1. Identifisere og isolere organismen som produserer det kjemikaliet man ønsker seg. 2. Avle frem organismer med mutasjoner som fører til overproduksjon av produktet. Teknikker for å øke mutasjonsraten beskrives senere, i avsnittet om mutagener. 3. Lab- og pilotprosjekt, der man finner optimale vekstforhold og slikt. 4. Til slutt, produksjon på industriell og kommersiell skala. Alternativer til denne fremgangsmåten innebærer målrettet modifisering av DNA-et til en organisme for å frembringe det ønskede produktet ( metabolic engineering ). Figur 4: Forskjellige typer cellemetabolisme. I black box -modellen anter vi at veksten i biomasse er proporsjonal med biomassen (altså enkel eksponensiell vekst). Proporsjonalitetskonstanten µ kalles spesifikk veksthastighet, og er et resultat av at man dumper alle faktorer som kan påvirke veksthastigheten i én og samme parameter. Ligningen for biomassen blir dm dt = µm, der m er biomassen. Hvis biomassen er m 0 ved t = 0, er løsningen på differensialligningen at m = m 0 e µt. Hvis vi måler tiden t d som det tar biomassen å fordoble seg, kan vi regne ut µ. Siden m = 2m 0 ved t = t d, blir ligningen 2m 0 = m 0 e µt d, så t d = ln 2 µ = µ = ln 2 t d. En slik enkel modell har naturligvis sine begrensninger - for eksempel forutsier den at en E. coli-bakterie med masse m 0 = g som deler seg etter t d = 20 min (realistisk ved optimale vekstbetingelser) i løpet av 44 timer vil rekke å vokse til en koloni på størrelse med jordkloden. Produktivitet kan oppgis som total produktivitet i milligram pr. sekund eller tonn pr. år; volumetrisk produktivitet som gram pr. liter pr. time; eller spesifikk produktivitet som gram pr. gram biomasse pr. time. Bioreaktorer Større ståltanker der man lager optimale vekstforhold for ønskelige mikrober ved å kontrollere Temperatur: høy temperatur steriliserer utstyret og forhindrer forurensning. Lav temperatur hindrer vekst av mikrober, men dreper dem ikke - derfor kan kulde brukes for å oppbevare mikroorganismer. Trykk: høyt trykk inni reaktoren forhindrer forurensende organismer fra å komme inn i reaktoren. Fuktighet: det finnes et optimalt fuktighetsnivå for mikroorganismene. ph: ved å kontrollere ph kan man forhindre vekst av uønskede mikrober og oppfordre til vekst av mikrobene man ønsker. 4.3 Eksempler Lysin Essensiell aminosyre som i naturen kun finnes i små mengder i korn. Man ønsker derfor å produsere lysin industrielt til f.eks dyrefôr. Lysin kan blant annet hentes fra Corynebacterium glutamicum. For å få organismen til å produsere lysin i store mengder, må man forhindre negativ feedback: proteinet som lager lysin, aspartatkinase, blir deaktivert dersom det er både lysin og treonin til stede (treonin blir produsert litt senere i den metabolske prosessen via homoserin dehydrogenase). Hvis man finner en organisme med en mutasjon som forårsaker defekter i denne selvreguleringen, kan man produsere lysin i store mengder. To slike mutasjoner har blitt funnet: det finnes mutanter med en mutasjon i homoserin dehydrogenase forhindrer produksjon av treonin, slik at det alltid er lave treoninnivåer og aspartatkinase aldri blir deaktivert, og en med en mutasjon i aspartatkinase som gjør at det ikke deaktiveres av lysin. 10

11 Glutamat Aminosyre som kan brukes som tilsetning i produsere kortison (diosgenin). Da de tidoblet prisen, mat for å få umami-smak. Glutamat dannes i sitronsyresyklusen. Den samme bakterien som ble brukt for produksjon av lysin, Corynebacterium glutamicum, har en lite aktiv svarte markedet ved å se etter alternative metoder som etter hvert erstattet den meksikanske råvaren, og markedet for diosgenin kollapset. variant av enzymet oksoglutarat dehydrogenase. Dette ville forårsaket en opphopning av 2-oksoglutarat i cellen hvis det ikke hadde vært for et annet enzym, glutamat dehydrogenase, 4.4 Antibiotika som konverterer 2-oksoglutarat til L-glutamat når det er ammoniumioner tilgjengelig. Ved å boble ammoniakk gjennom en bakteriekoloni kan man dermed produsere cillinens bakteriedrepende egenskaper, var det tre proble- Penicillin Etter at Alexander Fleming oppdaget peni- store mengder glutamat. Et siste problem er hvordan man mer som måtte løses for å kunne produsere penicillin billig får cellen til å skille ut glutamat i stedet for å la det hope og i store mengder: seg opp i cellen. Løsningen kommer fra at bakterien ikke 1. Man måtte finne Penicillium-stammen som produserte mest penicillin. kan produsere biotin, en viktig komponent i cellevegger, men er avhengig av at det finnes i omgivelsene. Ved å 2. Man måtte finne en metode for å gro store mengder gro bakteriene i et medium med minimale mengder biotin av bakterien. (akkurat nok til å tillate cellevekst) får man bakterier som 3. Man måtte finne en metode for å isolere penicillin slipper glutamat gjennom celeveggene. fra vekstmediet. Det første problemet ble løst ved at man fant en svært effektiv penicillium-sopp på en cantaloupe i Peoria, Illinois - all sopp som brukes for å produsere penicillin i dag, er muterte etterkommere av denne soppen. Det andre og tredje problemet løses med bioreaktorer. Mikrobiell produksjon av aminosyrer Syntese via mikrober fungerer gjerne mye bedre enn kjemisk syntese hvis man skal produsere stereokjemisk komplekse molekyler, for eksempel biologiske aminosyrer som finnes i L-form som er biologisk aktiv og D-form som er biologisk inaktiv. Med kjemisk syntese ender man opp med rasemater Mutagener - 50/50-blandinger av L- og D-formen, slik at halvparten av produktet er ubrukelig. Mikrobiell produksjon gir et produkt i 100% L-form (siden enzymene i mikrobene er laget for å produsere L-formen). Vitamin C Også kjent som L-askorbinsyre. Vitamin C kan ikke produseres av menneskekroppen og må derfor være i maten man spiser. Reichstein-metoden for å produsere Vitamin C er en kombinasjon av kjemisk syntese og bioteknologi som består i å 1. redusere D-glukose til D-sorbitol med nikkelkatalysator, 2. la Acetobacter suboxydans konvertere D-sorbitol til L-sorbose med sorbitol dehydrogenase (nesten 100% effekt etter 2 dager), og til slutt 3. kjemisk oksidere L-sorbose til 2-keto-L-gulonsyre, som i sur løsning danner L-askorbinsyre. Aspartam Søtningsstoff som kan dannes av aspartat og fenylalanin, som begge produseres av bakterier eller med enzymer i bioreaktorer. Varer kun i 6-9 måneder, og er noget dyrere enn sakkarin og enzymprodusert fruktose - men hvis noen en dag finner en måte å bruke rekombinant genteknologi til å lage aspartamproduserende bakterier vil det trolig få en større markedsandel. Her er det gode muligheter, folkens. For å finne sopp med mutasjoner som øker penicillin-produksjonen, ønsker man å øke mutasjonsraten - det er dessverre umulig å gjøre en målrettet mutasjon av bare ett gen, så man peiser på med mutasjoner og satser på at en av mutasjonene fungerer. Mutagener som øker mutasjonsraten inkluderer UV-stråling, som gjør at nabo-tymin i DNA dimeriserer. ioniserende stråling (røntgenstråler, gammastråler, nøytronstråler). diverse kjemikalier som reagerer med DNA-basene eller påvirker kopieringsprosessen. Bruk av mutagener er en generell teknikk som er spesielt nyttig når man bare ønsker en mutasjon i ett gen. Det er litt verre med produksjon av sopp og bakterier som skal lage antibiotika, siden produksjonen avhenger av mange forskjellige gener. Derfor var det nødvendig med mange runder med seleksjon over et par tiår for å kunne gå fra penicilliumsoppen på cantaloupen i Peoria, til dagens penicillin-produsenter som produserer opp til 2000 ganger så mye penicillin. For å skape virkelig effektive organismer kan man avle frem flere forskjellige stammer parallelt, og etter flere generasjoner med kunstig seleksjon lage hybridorganismer av de forskjelilge datterkoloniene. Se boks 4.7. Merk at superproduserende organismer ikke selv tjener noe på å lage en masse penicillin - de har bare dukket opp fordi mennesker i hvert trinn har valgt ut organismene som tilfeldigvis produserte litt mer penicillin. Kortison Smertedempende stoff som kan produseres syntetisk med en komplisert prosess på 37 trinn, der noen av trinnene krever ekstreme forhold, til en pris på $260 pr. gram. Ved å ta i bruk mikrobiell hydroksylering kan syntesen kuttes ned til 11 trinn som alle skjer ved normale Virkemåten til penicillin betingelser, og prisen faller til $1,30 pr. gram. Frem til 1975 hadde den meksikanske produsenten Proquivenex monopol på utgangsstoffet som ble brukt til å Penicillin dreper (Gramnegative) bakterier ved å forhindre produksjon av cellevegger. Dette gjør den ved å ha en β-laktamring som imiterer peptidbroa i celleveggen. Resultatet er at celleveggen blir så svak at cellen sprekker. 11

12 Streptomycin og cephalosporiner Alternative antibakterielle stoffer som er nødvendige for å drepe Gramnegative bakterier, samt Gram-positive bakterier som har blitt resistente til penicillin. Resistens Bakterier kan bli penicillin-resistente ved å produsere β-laktamaser som bryter ned β-laktamringen i penicillin. Som svar på dette har man laget nye semisyntetiske varianter av mikrobiell antibiotika, men hvert nye antibiotikum er bare en midlertidig løsning før det dukker opp nye bakterier som er resistente til dét også. Hvorfor er overforbruk av antibiotika farlig? Overforbruk av antibiotika vil føre til at resistente bakterier dannes, fordi man skaper et miljø der kun de antibiotikaresistente bakteriene overlever. Siden bakterier kan utveksle arvemateriale horisontalt via plasmider, vil et antibiotikaresistansgen kunne spre seg raskt gjennom bakteriekolonien. Cyclosporin I jakten på nye former for antibiotika oppdaget man at Tolypocladium inflatum lager et ringformet peptid som, i tillegg til å være et OK antibiotikum, har en immundempende effekt. Peptidet, cyclosporin, var det første immundempende stoffet som ikke var så kraftig at det satte hele immunsystemet ute av spill. Cyclosporin binder seg spesifikt til visse reseptorer på T-celler og forhindrer reaksjonen av interleukin-2 (et signalmolekyl som setter i gang betennelsesreaksjoner). Oppdagelsen førte til en dramatisk økning i vellykkede organtransplantasjoner, fordi man på noenlunde kontrollert vis kunne forhindre immunsystemet i å avvise det transplanterte organet. 5 Medisinsk bioteknologi Dette kapittelet handler om virus og hvordan de fungerer, immunforsvaret, og hvordan vi kan bruke vaksiner til å sette immunforsvaret på rett kurs. 5.1 Virus Virus Et virus er en liten genetisk enhet/agens/dingsboms som benytter seg av den reproduktive mekanismen til verten den infiserer for å reprodusere seg selv. Siden virus ikke har sin egen metabolisme, regnes de ikke som levende organismer i seg selv (de er i beste fall på grensen). Nakne virus er beskyttet av en proteinkjerne som kalles et kapsid. Enveloped viruses beskytter seg selv ved å ta med seg en bit av vertens cellemembran som et ekstra lag med beskyttelse. Noen virus koder for enzymer som de trenger for å reprodusere - blant annet har retrovirus revers-transkriptase, som brukes for å lage DNA fra RNA. Kort sagt klarer virus å pakke inn utrolig mye sluhet i et vanvittig lite volum (de har typisk en lengde på rundt 50 nanometer). Virus kan enten inneholde RNA eller DNA. Eksempler på RNA-virus er HIV, meslinger, rabies, tobakkmosaikkvirus, poliovirus, forkjølelse og SARS. Eksempler på DNA-virus er kopper, kukopper, herpes og bakteriofager. Lytisk angrep Viruset binder seg til overflaten av cellen og injiserer det genetiske materialet. Cellens egne enzymer og ribosomer sørger for å lage mange kopier av virusets bestanddeler ved å replikere det virale genmaterialet og produsere de virale proteinene. Til slutt setter de forskjellige bestanddelene seg sammen til mange nye, hele virus, som destruerer cellen som skapte dem og sprer seg videre i miljøet (eller, hvis cellen er del av en flercellet organisme, resten av organismen). Sovende viralt DNA Etter å ha infiltrert verten kan viruset, i stedet for å umiddelbart reprodusere og destruere cellen, forbli inaktivt. Det virale DNAet blir replikert sammen med resten av cellen når cellen deler seg. Først senere, etter flere celledelinger, slår viruset til. Ikke-lytisk angrep Viruset angriper på andre måter enn å ødelegge cellen, for eksempel når et enveloped virus tar med seg litt cellemembran. Enkelte virus kan også angripe celler ved å integrere genomet sitt i verten. Antivirale medisiner Antibiotika har ingen effekt på virus, siden virus ikke har noen egen metabolisme som antibiotika kan angripe. I stedet forsøker man å tukle med hver av de forskjellige stegene i virusets reproduksjonssyklus: Fusjonshemmere: forhindrer viruset fra å trenge inn i cellen ved å binde seg til de samme reseptorene som viruset binder seg til når det skal trenge inn i cellen. Transkriptasehemmere: molekyler som stikker kjepper i hjulene for reverstranskriptaseenzymet til retrovirus ved at de ligner på nukleotider, slik at enzymet feilaktig setter inn transkriptasehemmeren i polynukleotidkjeden. Dette fører til ubrukelig DNA som ikke kan leses. Integrasehemmere/antisense RNA: RNA som er eksakt komplementært til virusets RNA, og binder seg til det. Dermed dannes et ubrukelig RNA/RNAhybrid som ikke kan brukes til å danne nye viruskomponenter. Proteasehemmere: klipper opp de virale polypeptidene i små fragmenter akkurat når de skal settes sammen til nye virus. Naturlige strategier mot virus Blant menneskelige cellers naturlige forsvarsmekanisme mot virus finnes inhibitorer som blokkerer reversskriptase (mot retrovirus), antistoffer (senere avsnitt), og interferoner (neste avsnitt). Interferon Signalprotein som produseres av virusinfiserte celler for å si ifra til immunsystemet om at cellen er infisert og skal destrueres. 5.2 Immunforsvar Immunsystemet Det komplekse systemet som gjør organismen i stand til å skille mellom selv og ikke-selv. Immunsystemet består av den humorale immunresponsen og den cellulære immunresponsen. Man kan også dele det 12

13 inn i medfødt og adaptiv immunrespons - mer om det senere. Her er en fin video som forklarer immunsystemet: En del av det som står i Renneberg nevnes også i videoen, og gjentas derfor ikke her. På samme Youtube-kanal finnes også beskrivelser av mekanismene til forskjellige virus (meslinger, HIV, ebola). #viralvideo Den humorale immunresponsen bruker antistoffer - proteiner som produseres av B-celler (eller mer presist: B-celler produserer plasmaceller, som produserer antistoffer) for å beskytte mot fremmede stoffer (for eksempel fra infiserende virus/bakterier) som i denne sammenhengen kalles antigener. Antistoffer binder seg til antigener på svært spesifikt vis for å markere dem som inntrengere og oppfordre makrofager til å spise dem opp. Epitop Den delen av et antigen som antistoffet binder seg til. Kalles også antigendeterminant. Adaptiv immunrespons Den delen av immunresponsen som husker hvilke antigener som har vært til stede tidligere. Ved første eksponering for et patogen vil den adaptive immunresponsen være tregere - men ved senere eksponeringer vil den adaptive immunresponsen være like rask som, og mer effektiv enn, den medfødte immunresponsen, se Figur 5. Dette fordi det da finnes minne-celler (dette er spesialiserte T- og B-celler) som husker den første eksponeringen og vet hvordan immunsystemet må handle for å raskt og effektivt eliminere akkurat dét patogenet. Det er denne egenskapen til immunsystemet som utnyttes med vaksiner. Strukturen til et antistoff Antistoffer består av 4 proteinkjeder - to lette L-kjeder og to tunge H-kjeder. Proteinkjedene holdes sammen av disulfidbindinger. Disse settes sammen til en Y-form (se figur i bok/internett). Bunnen av Y-en er en fot som kalles Fc (fragment constant) som holder antistoffet til overflaten av B-cellen. Samtidig har de en variabel region - Fv - som er antigen-spesifikk. Cellen har standardiserte polypeptidelementer som den kan bruke for å bygge molekylære antistoffer for opp til forskjellige antigener (men man har altså ikke gener for hvert eneste antigen - det ville vært uøkonomisk). Den cellulære immunresponsen består av T-cellene. Blant disse har man cytotoksiske T-celler ( killer T-cells ) som er på utkikk etter fremmede komponenter på overflaten til cellene de møter - og hvis de finner fremmede komponenter, destruerer de cellen. Mange celler hjelper til med dette ved å kutte ut et fragment av peptider som stammer fra nedbrytningen av proteinene til en inntrenger. Dette fragmentet transporteres til overflaten av cellemembranen, der MHC-proteiner (major histocompability complex) viser frem fragmentet til omverdenen. I tillegg til cytotoksiske T-celler finnes det T-hjelpeceller som fremmer vekst av B-celler og cytotoksiske T-celler når de trengs. Neopterin En liten molekylær forbindelse som skilles ut av makrofager når de stimuleres av interferon-γ (som skilles ut av T-hjelpeceller). Dette skjer allerede før immunsystemet har identifisert intrengeren, så å teste neopterinnivåene i blodet gir en rask test for virusinfeksjoner: en høy konsentrasjon av neopterin indikerer at det foregår et eller annet viralt angrep. Siden det skilles ut uavhengig av hvilket virus som angriper, er det spesielt nyttig for å teste bloddonorer. Medfødt immunrespons Betegnelsen for den delen av immunresponsen som er rask, men uspesifikk. Dette er den evolusjonært eldste delen av immunsystemet, i motsetning til... Figur 5: Skisse av immunrespons ved første og andre eksponering for et patogen. Rødt: medfødt immunrespons. Blått: adaptiv immunrespons. 5.3 Vaksine Vaksine Immunogent materiale som gjør at immunsystemet produserer minne-celler for en bestemt type patogen (sykdomsfremkallende virus eller mikroorganisme). Dette gjør at immunsystemet raskt kan produsere riktig type antistoffer dersom patogenet skulle angripe på et senere tidspunkt. Dermed blir man (i det ideelle tilfellet) immun mot patogenet. Den første vaksinen var mot kopper, og ble utført ved at Edward Jenner testet sin hypotese om at det å overleve kukopper gir en livslang immunitet mot både kukopper og kopper: han injiserte en liten dose puss fra en kukoppinfisert jente i blodet til en gutt. To uker senere injiserte han den samme gutten med en potensielt dødelig dose kopper. Gutten overlevde dette, og begynte antakelig å gruble over hva i alle dager det var han hadde gjort for at det var akkurat han som ble valgt ut til et slikt latterlig uetisk eksperiment. Grunnen er at kukopper er nært beslektet med kopper, og de samme antistoffene som virker mot kukopper virker også mot kopper. Moderne vaksiner tar i bruk toksoider: nøytraliserte ekstrakter av toksinene som patogenene skiller ut døde eller svekkede patogener som er harmløse, men fortsatt trigger en immunrespons genmodifiserte varianter av patogener, som det for tiden forskes på Prinsippet er det samme i hvert tilfelle: kroppen produserer de riktige antistoffene før en eventuell infeksjon. 13

14 Polyklonale antistoffer Ved å immunisere et dyr mot et antigen kan man (ofte etter flere omganger med immunisering) hente ut og isolere antistoffer for antigenet fra dyret. Hvis man gjør det på denne enkleste mulige måten får man polyklonale antistoffer - en blanding av forskjellige antistoffer som alle reagerer på det samme antigenet, men som har forskjellig aminosyresekvens og binder seg til forskjellige steder (epitoper) på antigenet med forskjellig styrke. Monoklonale antistoffer Antistoffer med identisk molekylær struktur og spesifisitet, som stammer fra én enkelt type B-celler. Disse kan man få tak i ved å ta B- celler og fusjonere dem med tumorceller for å få en hybridcelle som er udødelig og deler seg raskt (som en kreftcelle), men også produserer de samme antistoffene som B-cella. Monoklonale antistoffer er et kraftig analytisk verktøy fordi man kan bruke dem til å oppdage små mengder av et antigen (for eksempel ved å sette en radioaktiv markør på antistoffene, slik at områder med antigenet lyser opp ). Dermed kan man for eksempel finne størrelsen og posisjonen til en tumor. Kombinert med annen teknologi kan man også levere medikasjon spesifikt til der antigenet befinner seg (targeted drug delivery). ELISA-testen Står for enzyme-linked immunosorbent assay og kan brukes til å finne ut om pasienten har produsert antistoffer mot et bestemt virus - det vil si, om pasienten er infisert. Prosessen er som følger: 1. Man gror viruset og isolerer kapsidet ved at det adsorberes på en plate. 2. Kroppsveske fra pasienten legges til på platen. 3. Man legger til enzym-markerte monoklonale antistoffer mot pasientens antistoffer. 4. De monoklonale antistoffene som ikke har bundet seg, vaskes vekk. 5. Man legger til et substrat som er fargeløst, men som skifter farge i møte med enzymet på de monoklonale antistoffene. Løsningen vil bli farget hvis det er noe enzym der, som kun kan være tilfelle dersom det var noen antistoffer de monoklonale antistoffene kunne binde seg til - altså hvis pasienten har vært infisert. Ellers vil alle de monoklonale antistoffene vaskes ut, og løsningen forblir fargeløs. Rekombinante antistoffer Det er ofte nyttig å gjøre antistoffet er så lite som mulig. Dette har tradisjonelt blitt gjort ved å kløyve av alt annet enn den variable delen (Fv) av antistoffet. Hvis du ser på Box 5.3 ser du at en slik enkeltstående Fv-bit ikke vil være sammenhengende, og faller fra hverandre uten ekstra stabilisering. Derfor bruker man en ekstra peptidkjede for å lenke sammen de to halvdelene, for å få en scfv (Box 5.3, nederst til høyre). Tradisjonelt har dette blitt gjort med proteaser, men nu til dags lager man dem heller fra scratch med rekombinante organismer. En fordel med rekombinante antistoffer er at det er mer etisk å lage antistoffer slik, enn det er å la dyr eller mennesker produsere antistoffene man vil ha. Det er også billigere og raskere, og ved å bruke E. coli kan man utnytte alt man vet om bakterien i produksjonen. 6 Miljøbioteknologi Dette kapittelet begynner med en lengre innføring i forurensning av ferskvann og hvordan vi kan forhindre det. Så går vi nærmere på hvordan vi kan bruke mikroorganismer som mer miljøvennlige energikilder og kjemikalieprodusenter. Avløpsvann Det er litt terminologi i forbindelse med avløpsvann: 1. 5-dags Biochemical Oxygen Demand (5-day BOD): mengden O 2 (aq) som metaboliseres av mikrobene i en vannprøve i løpet av 5 dager for å fullstendig bryte ned de organiske forurensningene i prøven. 2. Population equivalent (PE): den gjennomsnittlige organiske forurensningen, altså 60 gram 5-dags BOD. Siden løseligheten til O 2 i vann er 10mg O 2 pr. liter vann, trenger man 6000 liter rent vann for å fjerne forurensningen som én gjennomsnittlig bybeboer produserer i løpet av 5 dager. Konsekvensene av urenset avløpsvann som slippes ut i innsjøer og elver, er at aerobe mikroorganismer bryter ned organisk materiale og bruker samtidig opp tilgjengelig oksygen, fisk og de fleste andre oksygenavhengige organismer dør av oksygenmangel, og til slutt anaerobe mikroorganismer tar over og produserer giftig ammoniakk (NH 3 ) og hydrogensulfid (H 2 S) som dreper de resterende vannlevende organismene. Dermed ender man opp med at elvene blir til illeluktende kloakk. Aerob vannrensning Et vanlig kloakkrenseanlegg bruker aerobe mikroorganismer til å bryte ned forurensninger i vannet før det slippes ut i ferskvannskildene. Dette krever en del plass. Trickling filters En annen metode for å rense avløpsvann. Dette er tanker fylt med porøst materiale med et stort indre overflateareal der mikroorganismer kan sette seg. Dette store overflatarealet gjør at man sparer en del plass. Aktivert slam En tredje metode for å rense avløpsvann. Her har man latt aerobiske bakterier, fungus og andre mikroorganismer danne store flak som andre mikrober kan sette seg på. I tillegg rører man i vannet for å stadig tilføre oksygen fra luften. Vannrensning med aktivert slam består av følgende trinn (se gjerne på figur på slide): 1. Avløpsvann går inn i en oppbevaringstank. 2. Større objekter fjernes med mekanisk filter. 3. I et gruskammer : væskeflyt justeres, og større partikler som grus, sand og glass fjernes. 14

15 4. I en sedimenteringstank: flakene av mikroorganismer, samt den løselige komponenten av avløpsvannet, separeres fra uløselig bunnfall (sedimenter). 5. Flakene og den løselige komponenten av avløpsvannet brytes ned under aerobiske forhold for å lage aktivert slam (som beskrevet i starten av avsnittet). 6. Rent vann separeres fra slammet. Deler av slammet resirkuleres. 7. Slammet sendes til et fordøyelsestårn der det produseres biogass. 8. Rent vann separeres fra restene av slam fra fordøyelsestårnet. Det siste slammet kan ende opp i spesialiserte dynger, der lukt kan bli et problem. 9. Drikkbart vann behandles med klor eller ozon for å drepe bakterier, før vannet sendes ut i elva. Eutrofiering Avrenning av fosfor og nitrogen (i gjødsel) fra landbruk, med påfølgende opphopning av slike næringsstoffer i miljøet. Dette fører til ukontrollert oppblomstring av alger, som igjen degraderes av aerobiske mikroorganismer som bruker opp det som er av tilgjengelig oksygen. Til slutt ender man opp i samme situasjon som man får fra å slippe ut urenset avløpsvann i ferskvannsområdene. Fjerning av nitrogen Først bruker man Nitrosomonas til å oksidere ammoniakk til nitritt (NO 2 ). Deretter bruker man Nitrobacter til å oksidere nitritt til nitrat (NO 3 ). Til slutt reduseres nitratet til nitrogengass 1. Fjerning av fosfor Det finnes to metoder: fosforet kan enten tas opp av bakterier (som man så lagrer som biosolids som brukes som gjødsel), eller det kan presipiteres ut kjemisk med jern- eller aluminiumsalter. Det går bedre med biogass i Kina, der det kjøres mange hundre tusen bioreaktorer, ofte som kommunale prosjekter. I den industrialiserte verden kan bioreaktorer hjelpe til med å løse avfallsproblemene til industrielle gårdsbruk. På grunn av begrenset mengde biomasse kan ikke biogass dekke stort mer enn 1-5% av energibehovet. Husholdningsavfall som ellers ville havnet på avfallsdynger er en annen potensiell kilde til biogass - det produseres allerede så mye metan på avfallsdynger at det kan være farlig, så det kan være gunstig å dekke dem opp og ekstrahere metan derfra. Naturlig forekommende metan Mikroorganismer som enten lever fritt eller i fordøyelsessystemene til større organismer, produserer totalt mellom 500 millioner til 1 milliard tonn metan i året, omtrent det samme som det som ekstraheres fra naturgassfelt. Eksempler er I myrer og sumper kommer det en del metan fra bakterier som dekomponerer organisk materiale i fravær av oksygen. Mikroorganismer i magen til en ku produserer liter metan. Termitter er de største produsentene av metan: en maur produserer 0.5 milligram metan om dagen, som blir til en årlig produksjon på 150 millioner tonn. Bioetanol I Brazil finnes det en del bioetanoldrevne biler som går på hydrert etanol (93% etanol/7% vann). Dette ble satt i gang på grunn av oljekrisene i 1973/4 og Prosjektet heter Proalcool og var en både politisk og økonomisk motivert affære som har vist seg å være kontroversiell fordi bioetanolproduksjon konkurrerer med matproduksjon: én bil krever like mye råmateriale som mat for 30 mennesker. produksjonen har en alvorlig effekt på miljøet: hver liter etanol som produseres danner liter sukkerrester og 100 liter skittent vann, som av økonomiske grunner slippes ut i elver uten å renses. Bioetanolproduksjonen fører også til erosjon av jordsmonnet. Problemet med vannforurensning er på bedringens vei: etter at forurenset vann fra bioetanolindustrien forurenset drikkevannforsyningen til hele byer, beordret den brazilianske regjeringen alkoholindustrien til å holde vannet i en lukket syklus og til å bruke sukkerrestene som gjødsel. Biogass Metanogene arkebakterier kan konvertere organisk materiale til metan, som kan brukes som en energikilde. Dette skjer i en anaerob prosess: 1. Hydrolytisk fase: ekstracellulære enzymer bryter ned store organiske molekyler til enklere bestanddeler som monosakkarider, aminosyrer, glyserol og fettsyrer. 2. Acidogen fase: de enkle bestanddelene brytes ned til H 2, CO 2, eddiksyre og andre organiske syrer og alkoholer. 3. Metanogenese: Hydrogen, eddiksyre og karbondioksid reagerer med hverandre for å danne vann og metan i to reaksjoner: CH 3 COOH CH 4 + CO 2 og CO 2 + 4H 2 CH 4 + 2H 2 O. Oljedegraderende bakterier Biogass er en fin energikilde dersom det eneste andre alternativet er å brenne ved eller annen biomasse. Biogass kan dannes i små reaktorer som fylles med ekskrement fra mennesker og dyr. Men: da man prøvde dette med Gobarprosjektet i India, ble prosjektet forringet av at det kun er rike bønder som har råd til de rustfri ståltankene man trenger og har nok avfallsstoffer til å fylle tankene. Det endte opp med at rike bønder kjøpte opp kumøkk i store kvanta og dermed brukte opp biomassen som de fattige ellers ville brent for varme. 1 Slides strider med Renneberg og internett: reduksjonen av nitrat gjøres ikke biologisk. Etter å ha oppdaget at det finnes bakterier som kan degradere plantegiften Agent Orange, klarte Ananda Chakrabarty å produsere oljespisende bakterier ved å kombinere plasmider fra fire Pseudomonias-stammer som hver for seg var i stand til å degradere enten kamfer, oktan, xylol eller naftalen. Plasmidene ble kombinert til superplasmider som ble reintrodusert i bakterier slik at de ble i stand til å degradere alle de fire stoffene. Disse organismene var ment til å raskt spise opp oljeutslipp og så bli spist opp av organismer høyere opp i næringskjeden. Organismene er de første genmodifiserte organismene som har blitt patentert i USA. 15

16 Organismene har riktignok aldri blitt brukt, på grunn av restriksjoner på bruk av genmodifiserte organismer. I på vei med termofile og etanoltolerante mikroorganismer. stedet gror man konvensjonelt fremavlede bakterier for å Eddiksyre: produseres fra oksidering av etanol degradere olje på oljedekte steiner, som er det eneste som er lovlig å gjøre i dag. av Acetobakter, men høykonsentrert eddiksyre produseres ved kjemisk karbonylering av metanol. Et miljøvennlig bruksområde for eddiksyre er dannelse av kalsiummagnesiumacetat til salting av veier. I Sukker og alkohol fra trevirke Den ideelle råvaren motsetning til natriumklorid fører det ikke til korrosjon i biler eller til tredød ved å konkurrere med for å lage glukose og alkohol er stivelse, et polysakkarid som brukes som energilager i planter. Stivelse er et viktig næringsstoffene til planter. næringsstoff og er derfor kontroversielt å bruke industrielt. n-butanol: viktig organisk løsemiddel. Clostridium Den nest beste råvaren er lignocellulose fra trevirke, acetobutylicum produserer n-butanol med aceton som som ikke kan brukes som en matressurs, men er et råmateriale i papirindustrien. Lignocellulose er en 4:3:2-blanding problemet løses ved å bruke immobiliserte mikroor- biprodukt. n-butanol er giftig for bakterier, men det av cellulose, hemicellulose og lignin, eller kan hentes fra ganismer. levende planter, og som biprodukt fra jordbruk og trevirke Glyserol: løsemiddel og lubrikant. Kan produseres (sagflis). med de samme mikrobene som man bruker for å Noen problemer med lignocellulose som sukker- og alkoholkilde, er: binder seg til et viktig mellomprodukt i biologisk produsere etanol, ved å legge til natriumsulfitt som Cellulose er krystallint, uløselig i vann og vanskelig nedbrytbart for de fleste organismer. Men treormer, termitter og visse sopper kan degradere cellulose med etanolsyntese. Sitronsyre: konserveringsmiddel, smakstilsetning og vaskemiddel. Produseres av Aspergillus-soppen. cellulaser. Melkesyre: syreregulerende middel og konserveringsmiddel. Degraderingsproduktene til lignin er giftige, slik at lignocellulose må syrebehandles før enzymdrevet nedbrytning. Cellulaser hemmes av sine egne produkter (glukose og cellobiose), og er uansett temmelig treige. Hvitråte-sopp kan degradere 60 til 70 prosent av ligninet til karbondioksid, vann og hvit cellulose. Dette gjør de med ekstracellulære peroksidaser som bryter bindingene mellom Produseres av Lactobacillus. Kan dehy- dreres til den sykliske laktonen laktid, som videre kan polymeriseres til den bionedgraderbare polyesteren polylaktat. Glukonsyre: lages av Aspergillus niger fra glukose via glukoseoksidase. Kan brukes som biosensor for å måle glukoseinnhold. Binder metallioner og forhindrer kalsiumflekker på glass. fenolene i lignin. Hvor hvitråte får hydrogenperoksiden som trengs for å drive denne reaksjonen fra, er et lite mysterium, men man lurer på om ikke det kan komme fra Er produksjon av industrielle kjemikalier fra fornybare kilder realistisk? Produkter med høy verdi som ekstracellulære oksidaser som glukoseoksidase, som lager skal produseres i lite volum, for eksempel aminosyrer, er H 2 O 2 som biprodukt ved oksidering av glukose. det ofte bedre å få tak i bioteknologisk. For kjemikalier Mulige strategier for å forbedre prosessen er å som skal produseres i store volumer er det gjerne billigere fremtvinge mutasjoner som fjerner negativ feedback å bruke fossile kilder - bruk av bioteknologiske løsninger i cellulaser avhenger da i stor grad av oljeprisen og økonomisk lønnsomme bioprosesser. klone cellulaser fra fungus til mer økonomiske bakterier gi bakterier evnen til å bryte ned 5-ringede sukkerarter Bakterier i gruvedrift Levende organismer kan brukes bruke mikrober som metaboliserer lignocellulose direkte for å danne etanol og organiske syrer lage nye enzymer som åpner opp krystallstrukturen til cellulose til å ekstrahere metaller fra årer i en prosess som kalles bioleaching. Omtrent 25% av kopperproduksjonen, 10% av gullproduksjonen og 3% av kobolt- og nikkelproduksjonen bruker levende organismer på denne måten. Mikrobene som brukes i kopperproduksjon er svovelbakteriene Acidithiobacillus ferrooxidans, som oksiderer Fe(II) Eksempler på kjemikalier fra biomasse De 100 mest til Fe(III) og angriper løselig svovel og uløselige sulfider for brukte kjemikaliene i industrien utgjør omtrent 99% av å konvertere dem til sulfater, og Acidithiobacillus thiooxidans, som vokser på svovel og løselige svovelforbindelser. massen av alle kjemikalier som brukes, og de 5 mest brukte kjemikaliene (eten, propen, benzen, toluen og xylen) utgjør I direct leaching får bakteriene energi ved å overføre omtrent 75% av alle kjemikalier som brukes. Kjemikaliene elektroner fra jern og svovel til oksygen på cellemembranen. kommer for det meste fra petrolium og naturgass, men De oksiderte produktene, som er mer løselige, kan dermed alternativt kan de fleste kjemikaliene utvinnes fra bioteknologi: lettere hentes ut. I indirect leaching oksideres Fe(II) til Fe(III), som i seg selv kan oksidere andre metallioner til Etanol: brukes som løsemiddel, antifrys, og som lettere løselige former. I praksis er det noe overlapp mellom utgangsstoff for syntese av mange andre organiske disse to prosessene. forbindelser. Det kan som kjent utvinnes med fermentering, og destillasjonsprosessen kan i dag hjelpes 16

17 MEOR står for Microbially Enhanced Oil Recovery, og er en betegnelse for tertiære oljeproduksjonsmetoder som brukes til å hente ut den siste oljen man ikke får tak i med primære og sekundære metoder. Én slik metode er å injisere bakterier som produserer gass og dermed øker trykket i reservene. En annen metode er å injisere mikroorganismer som Alger lager biosurfaktanter (bio-zalo), som bryter opp oljen i vannløselige dråper som lettere kan hentes ut fra porer i stein. En utfordring med slike løsninger er de ekstreme forholdene ved oljereservoarene: det er lite næringsstoffer og oksygen, høy saltkonsentrasjon, høyt trykk og høy temperatur, så kun ekstremofile mikroorganismer kan overleve der. Oljeprodusenter forsker også på bruken av biopolymerer som Xanthan, som produseres av plantepatogenet Xanthomonas campestris. Xanthan er et fortykkende stoff som gjør vann mer tyktflytende. Etter at biosurfaktanter har blitt pumpet inn i steinen, legger man til xantanfylt vann som utøver et trykk på oljen og presser den ut. Xanthan er fortsatt for dyrt til å være lønnsomt til slik bruk. Grønn er her i sammenheng med at vi snakker om planter, ikke at vi prøver å lage miljøvennlige løsninger (det var kapittel 6). 7.1 Mikrober Blant alger har vi makroalger og mikroalger. Alger som er store nok til at man kan se dem med det blotte øye kalles makroalger, resten kalles mikroalger. Makroalger er mer økonomisk lønnsomme enn mikroalger. Blant makroalger har vi brunalger, for eksempel tang og tare. Brunalger er råvaren for å lage alginat, agar, carrageenan og L- glutamat. Brukes i salater, supper, nudler eller med kjøtt. rødalger, som har blitt kultivert i Japan siden middelalderen. grønnalger, som antakelig er grønne. Blant mikroalger har vi blåalger som Spirulina, som egentlig ikke er alger, men cyanobakterier. De ble spist av indianerstammer i Sør-Amerika og i Afrika, og tas si dag som kosttilskudd for å redusere kolesterol og rense blodet. 100 gram spirulina inneholder 70 gram protein, 20 gram sukker, 2 gram fiber, 2 gram fett, samt en del viktige vitaminer og mineralsalter. Spirulina kan gros i algefarmer - store, flate vannbasseng - men det er fortsatt dyrere enn soyaprotein. Bioplast Plast som utledes fra fornybare kilder til biomasse, for eksempel vegetabilsk olje, stivelse og mikroorganismer. Mange, men ikke alle typer bioplast er laget for å kunne brytes ned biologisk i enten anaerobiske eller aerobiske miljøer. Eksempel på bioplast: Pullulan er et cellofan-lignende polysakkarid som ikke kan fordøyes av mennesker eller degraderes av Spiselige mikrober Mange mikrober inneholder verdifulle stivelsesnedbrytende amylaser, og brukes derfor som en kalorifattig tilsetning til mat for å øke viskositeten. Xanthan, som ble nevnt i forbindelse med oljeutvinning, brukes til det samme. Pullulan er også en bra lufttett matfolie som løser seg opp i varmt vann og kan nedbrytes mikrobielt når det er vått. Pullulan lages med Pullularia pullulans-soppen. Polyhydroksybutyrat (PHB), med navnet Biopol, har proteiner, fettsyrer, sukkerarter og vitaminer, og kan brukes som matkilder for å redusere sult. Eksempler på slike mikrober er mikroalger som Spirulina, samt gjær og bakterier. Som matkilde har mikrober den fordelen at de vokser svært fort: tiden det tar for en organisme å fordoble sin biomasse er 2 måneder for en kalv, 6 uker for en grisunge, 4 uker for en kylling, 2 uker for gress, 6 timer for mikroalger, 4 til 6 timer for gjær og 20 minutter til 2 timer de samme egenskapene som petroleumsproduktet for bakterier. Dessuten blir nesten alt fôret konvertert til polypropylen og produseres av bakterier som energilager (i så stor grad at bakteriene hovedsakelig består spiselig protein, i motsetning til en ku som bare inneholder kjøtt tilsvarende 9% av planteproteinet den spiser. av plast). PHB fra Alcaligenes eutrophus-bakterien er en høykrystallin bioplast med smeltepunkt nær 180 Single Cell Protein Produksjon av protein med celsiusgrader. Det brytes ned i en slik hastighet at mikroorganismer begynte under 1. verdenskrig, da man det kan brukes i kapsler for medisin som skal slippes avlet store mengder gjær som proteinkilde i pølser og supper. Gjær var nyttig fordi gjær benytter seg av ellers ut i kroppen over lengre tid, eller i sting (slik at de etter hvert fjerner seg av seg selv). ubrukelige sukkerløsninger, og kan konvertere sukker til Man forsøker å produsere edderkoppsilke med recombinant E. coli under navnet Biosteel. nyttig protein. Senere har man opdaget lignende organismer som spiser Polylaktat, under navnet NatureWorks PLA, dannes andre ubrukelige stoffer i råolje og konverterer dem til ved naturlig fermentering av kornstivelse og kan nyttig protein: brukes til å lage miljøvennlige konvolutter, dørmatter, CD-er og lignende. i Øst-Europa konsentrerte man seg om Candidagjærceller som spiste alkaner. Bruken av slike er begrenset, i frykt for at cellene lager kreftfremkallende 7 Grønn bioteknologi biprodukter. i Vest-Europa fant man gjær og bakterier som gikk på metanol, som man tenkte å bruke som dyrefôr. Dette Dette kapittelet handler om hvordan bioteknologiske ble ikke noen suksess, fordi EU-subsidier gjorde det løsninger kan øke matproduksjonen, redusere feilernæring og produsere medisiner som består av komplekse molekyler. billigere å bruke pulver av skummetmelk som tilskudd i dyrefôr, så da gjorde man heller det. 17

18 Oljekrisen bidro også til at begge prosjektene endte uten suksess. Mykoprotein Quorn er et vellykket matprodukt basert på det smak- og luktløse proteinet fra fungusen Fusarium venenatum. Men det kan transformeres til imitasjoner av fisk samt hvitt og rødt kjøtt fordi det består av omtrent det samme som kjøtt (50% protein, 13% fett, 25% fiber), og man kan kontrollere lengden og finheten til fibrene ved å kontrollere hvor lenge man lar cellene vokse. En fordel med fungus i forhold til bakterieceller er at cellene gjerne er mye større og enklere kan separeres fra vekstmediet. Fusarium gror i en blanding av glukosesyrup og ammoniakk. 7.2 Planter Totipotente celler Planteceller er totipotente, som betyr at man kan gro en helt ny plante fra en enkelt celle, så lenge man har de riktige planteveksthormonene. Disse hormonene inkluderer auxiner, som regulerer vekst og differensiering, og cytokiner, som fremmer vekst av skudd og forhindrer vekst av røtter. Forholdet mellom auxiner og cytokiner blir dermed en viktig størrelse. Somatisk hybridisering Siden protoplastene mangler cellevegg kan de relativt enkelt fusjoneres, enten med kjemisk cellefusjon eller med elektriske felt (elektrofusjon). Slike teknikker, som kalles somatisk hybridisering, ble brukt for å lage pomatplanter - hybdrider av potet og tomat. Pomatene var uspiselige og ingen stor suksess, fordi de forskjellige karakteristiske komponentene i de to plantene ikke fungerer godt sammen. Slike problemer vil svært sannsynligvis dukke opp når man prøver seg på en somatisk hybridisering. Planteceller i bioreaktorer Man trenger ikke differensierte plantedeler for å produsere plantemateriale i en reaktor - callus er nok, hvis man leverer det som trengs av inorganiske salter, vitaminer, sukker og hormoner, samt rister på løsningen for å få overført nok CO 2 til plantene. Plantene vil da fortsette å gro, reprodusere og produsere planteprodukter i reaktoren. Planteceller i bioreaktorer brukes for å produsere mange ekstremt kompliserte forbindelser, særlig medisiner (steroider, kodein, atropin, reserpin, digoksin, digitoksin, quinin og Hyperzin A). Suspensjonskultur Det står ingenting om suspensjonskultur er, verken i Renneberg eller på slides, men det Meristem Den delen av en plante som aktivt deler seg (altså der planten begynner på et utskudd). Det er her nevnes i forbindelse med protoplastkultur, så jeg antar at cellene er minst differensiert (analogt med stamceller i det er synonymt med det. mennesker) Meristem kultur er bruk av celler fra meristem til å gro nye planter. Da skjærer man vekk en meristem og planter den på nytt i et vekstmedium. Agrobacterium En bakteriell genteknolog som brukes Siden planteceller er totipotente, særlig ved meristemene, er det på denne måten mulig å lage opp til for å genmodifisere planter. Bakterien tiltrekkes av molekyler som planten slipper ut når den er skadet. Denne kloner av den samme planten i løpet av ett år. Ved å gro bakterien har et såkalt Ti-plasmid ( Tumor-inducing plasmid fordi plasmidet forårsaker tumorvekst i planter). Ti- dem in vitro (i testtuber med cellekultur) kan man raskt produsere nye varianter av den samme planten og avle frem plasmidet har gener som koder for opin-detekterende proteiner. Opiner er spesielle aminosyrer som kun bakterien egenskaper som resistans mot sykdommer og plantegift. kan bruke, så bakterien reprogrammerer dermed plantecellen til sitt eget formål. I tillegg har Ti-plasmidet gener Haploide kulturer Pollenknappene (anthers) til planter er plantenes mannlige kjønnsceller, og inneholder kun ett for proteiner som overfører DNA til skadede celler. Dette er sett kromosomer. Fruktknutene (ovaries) er de hunnlige et skjeldent eksempel på at gener overføres fra en prokaryot kjønnscellene, og inneholder det andre settet med kromosomer. Slike celler som kun inneholder ett av de to settene til en eukaryot. Ti-plasmider kan temmes ved å fjerne genet for opindetekterende proteiner og plantehormoner (det er de plante- med kromosomer, kalles haploide (i motsetning til vanlige, diploide celler). Ved å gro celler fra pollenknapper i vekstmedium med hormoner kan man lage komplette, sterile hormondannende genene som forårsaker tumorene). Samtidig setter man inn de genene man måtte ønske i Tiplasmidet. Det er vanlig å inkludere et antibiotikaresistens- planter der alle cellene er haploide. Disse er nyttige til planteavl fordi recessive mutasjoner blir synlige. gen, slik at rekombinante celler kan velges ut enkelt (ved å bruke vekstmedium med antibiotika som dreper de ikkerekombinante bakteriene). De rekombinante plasmidene Callus En celleklump med plantemateriale; den uorganiserte massen av celler som vokser der man har laget settes enten direkte inn i protoplaster, eller de settes inn i et kutt i en plante. Slik callus kan tas ut og gros videre i Agrobacterium igjen (det sistnevnte er standardmetoden). vekstmedium. Protoplast Plantecelle der man har fjernet celleveggen (ved hjelp av cellenedbrytende enzymer som pektinaser og cellulaser). Når protoplaster vokser i vekstmedium vil de gjendanne celleveggene sine og danne calluser. Når plantehormoner dannes vil disse callusene få utskudd, og med andre hormoner vil disse utskuddene så slå røtter. Dermed kan man lage hele nye planter fra enkeltceller. DNA-pistol En metode for å genmodifisere planter. Gull- og wolframpartikler dekkes med plasmid DNA, og partiklene skytes inn i vev på en måte som ikke skader cellene. Av og til integreres plasmid-dnaet i plante-dnaet selv om partiklene selv passerer gjennom cellene. Denne metoden kan også brukes for å sette inn DNA i kloroplaster, eller i andre organismer enn planter. 18

19 Eksempler på transgene planter Planter kan gjøres resistante til glyfosfat ved å øke produksjonen av visse enzymer. Glyfosfat er en del av urgressmiddelet Round-Up som skader planter ved å hemme EPSP-syntase, et viktig enzym for aminosyremetabolisme. Genet for EPSP-syntase kan inkorporeres i rekombinant E. coli og overføres til planter via Agrobacterium. Dette gir planter med mye høyere konsentrasjon av EPSP, som gjør at de tolererer konsentrasjoner av Round-Up som dreper andre planter i området. Planter kan gjøres resistante til fosfinotricin (PPT) med PPT acetyl transferase. Fosfinotricin dreper planter ved å hemme syntesen av glutamin, med den konsekvens at ammoniakk akkumulerer og dreper cellen. PPT acetyl transferase, et enzym i blant annet tobakk, poteter og raps, nøytraliserer denne hemmelsen. Luciferase, enzymet som gjør ildfluer selvlysende, har blitt introdusert i tobakkplanter. Hvis det er luciferin og mye næringsstoffer i vannet til plantene (for eksempel hvis de vannes med avløpsvann), lyser de genmodifiserte plantene med en gulgrønn glød. Man har klart å lage blå nellik ved å introdusere genene for det blå pigmentet i petunia. Blå roser har man dessverre ikke kommet helt i mål med. Tomater kan få tykkere skinn med mer stivelse (fint for å lage ketchup) ved å slå av polygalaktuonidase (PG) med antisense-rna. Transgen raps og soya har høyere innhold av lysin (som beskrevet tidligere er lysin en essensiell aminosyre, så høyere innhold av lysin betyr høyere næringsverdi). Transgen raps inneholder også et annet spekter av fettsyrer enn vanlig raps, blant annet noen av fettsyrene i palmeolje. Det kan derfor hende at transgen raps erstatter palmeolje. Det gjøres forsøk på å lage planter som er resistante mot tørråtesopp. Slike planter produserer cellulase som angriper og løser opp celleveggen til tørråtesoppen. Genmodifiserte vindruer er et forsøk på å unngå de sykdomsfremkallende soppene som er et stort problem for tradisjonelle vindruesorter som Riesling, Merlot og Chardonnay. Golden rice er ris som har blitt modifisert til å inneholde en høy konsentrasjon av β-karoten (provitamin A). Det er kjekt å ha, fordi vitamin A-mangel er vanlig blant folk som hovedsakelig lever på ris: 800 millioner mennesker lider av akutt vitamin A-mangel som forårsaker at synet, immunsystemet, blodet og skjelettveksten svekkes, og er en stor grunn til blindhet og anemi. Med de nyeste variantene av golden rice kan man dekke opp til halvparten av det daglige vitamin A-behovet ved å spise ris. Man prøver å lage koffeinfrie kaffeplanter. Sikkert kjekt for de 20 prosentene av verdens befolkning som drikker decaf-kaffe. Noen driver og lager poppeltrær som samler opp tungmetaller. Det gjøres forsøk på å lage planter som tåler tørke og høye konsentrasjoner av salt. Biologisk insektmiddel Insektmidler har en del ulemper: de dreper andre insekter enn insektmiddelet er beregnet på og forstyrrer dermed balansen i økosystemer, de akkumulerer i større fugler og dyr, og insektene blir etter hvert resistente (som tradisjonelt løses ved å bruke større mengde insektmiddel, slik at insektene etter hvert blir enda mer resistente, og så videre). Det biologiske insektmiddelet Bt-toksin er et mikrobeprodusert krystallinsk protein som blir til gift i fordøyelsessystemet til larver og dermed perforerer dem fra innsiden. Bt-toksin er harmløst mot mennesker, fisk og varmblodige dyr. Ved å bruke de ovennevnte teknikkene for å inkorporere Bt-genet i planter får man et insektmiddel som kun påvirker insekter som er parasitter på planten. Refuge crops Man ønsker å unngå spredningen av Bt-gener samt utviklingen og spredningen av Bt-resistente insekter. Dette gjøres ved å gro de transgene plantene ved siden av ikke-transgene planter. Dermed sørger man for at ikke-resistente insekter overlever og parrer seg med eventuelle resistente insekter; recessive resistensgener vil ikke komme til syne i avkommet til disse. Trusler med transgene planter Kan genmodifiserte planter spre seg til andre områder og bli til ugress der, på samme måte som kaniner ble til skadedyr da de ble introdusert til Australia? Trolig ikke: det ser ikke ut til at genmodifiserte planter kan overleve i naturen - det har i hvert fall aldri blitt vist at de kan det 2. Eller kan transgene planter overføre sine resistensgener til ugress gjennom krysspollinering, og dermed forverre ugressproblemet? Spørsmålet undersøkes for tiden. En tredje bekymring er pollenspredning av genmodifiserte planter til ikke-genmodifiserte avlinger. Når det gjelder Bt-korn viser det seg at andelen genmodifiserte planter faller under 0.9% (som er terskelen for når genmodifisert mat skal markeres i en del land, for eksempel Norge) når man er 10 meter unna et felt med Bt-planter. Derfor skal bønder som gror Bt-korn ha en tjue meter tykk separerende stripe rundt avlingen, for å utelukke økonomisk skade for nabobøndene. Merking av genmodifisert mat Skal genmodifisert mat merkes? DNAet i seg selv har ikke noen metabolsk effekt, da det blir brutt ned raskt i fordøyelsessystemet. Hvis genmodifisert mat har noen effekt som gjør at den bør markeres, vil det være på grunn av proteinene som dannes av de innsatte genene, og det varierer naturligvis fra tilfelle til tilfelle. Dermed er ikke maten er genmodifisert i seg selv en god nok helsemessig grunn til å markere genmod- 2 Renneberg sier at det er slik as a general rule, men forklarer ikke hvorfor. Nå er det jo slik at genene vi avler frem i transgene planter er til nytte for oss, ikke for plantene selv. Det er derfor ikke noen grunn til å bekymre seg for at genmodifiserte planter får egenskaper som gjør dem mer levedyktige i naturen enn sine ikke-genmodifiserte søsterplanter. Se også Genetically Modified Foods Are Nothing New, lenket til i Tonsill B. 19

20 ifisert mat. Derfor er genmodifisert mat FDA-godkjent i USA. Man kan riktignok argumentere for at den skal markeres av andre grunner enn helse, for eksempel for å hensynta enkeltpersoners religiøse innvendinger mot genmodifisering. har fått et dårligere omdømme enn teknologien kanskje fortjener. 8 Kloning og embryoer Regulering i Norge Med enkelte unntak gjelder de Dette kapittelet handler om kloning av høyere ordens samme reglene i Norge som i andre europeiske land. Vi har organismer. Mot slutten, litt diskusjon rundt bruk av matloven, som regulerer bearbeidede mat- og fôrprodukter embryoer til andre ting enn kloning. som ikke inneholder levende, genmodifisert materiale, samt genteknologiloven om levende genmodifisert materiale Kloning Når en organisme får avkom som er genetisk (inkludert spiredyktige frø). Hittil har ingen genmodifiserte produkter blitt godkjent som mat eller fôr i Norge; før en eventuell godkjenning skal norske myndigheter ha gjennomført helt identisk. Eksempler på naturlig kloning er den aseksuelle reproduksjonen til bakterier, samt noen insekter og planter. en risikovurdering. Dersom fôr- eller matvarer med mer enn 0.9% genmodifisert materiale tilbys på markedet i Somatisk celle En celle som er en del av kroppen til en Norge, skal den være merket. organisme, det vil si alle andre celler enn kjønnsceller og stamceller (kapittel 9). Genopdrett Planter er ganger billigere å gro enn E. coli, og 100 ganger billigere enn dyreceller. Det er også Overføring av kjerne færre etiske kvalmer med å genmodifisere planter enn det er med å genmodifisere dyr, spesielt til medisinske formål. En annen viktig fordel med å bruke planter (og andre høyere organismer) til å gro gener, er at de kompliserte proteinene i høyere organismer modifiseres i cellen etter at de produseres (som vi så med insulin i kapittel 4). Det har allerede blitt laget tobakk med antistoffer mot karies, og poteter og bananer med innebygd vaksine. Slik mat, om den blir vellykket, kan ikke spises i for store doser og må derfor merkes tydelig, for eksempel ved å farge maten med en egen farge. Renneberg foreslår blå. Undertegnede er helt enig, og har alltid syntes at det er for lite blå mat på markedet. Andre etiske problemer med genmodifisert mat Potensielle økologiske trusler er nevnt i avsnittet om Trusler med transgene planter. Samtidig kan store felt med genmodifisert mat undergrave fornybart og alternativt jordbruk. Et problem som ikke er nevnt i Renneberg, men som er hintet til på slides, er at bruk av genmodifisert mat kan være mer lønnsomt for store bedrifter enn det er for små produsenter. Interesserte kan for eksempel lese seg opp på den kontroversielle businessmodellen til Monsanto, som er en viktig grunn til at bioteknologi og genteknologi En måte å lage kloner på, er å overføre kjernen fra en somatisk donorcelle til en eggcelle der man har fjernet kjernen. Eggcellen blir så til et embryo, som settes inn i en surrogatmor. Kloner som produseres slik er ikke egentlig genetisk identiske med organismen som donorcellen kom fra, siden klonen vil ha mitokondrielt DNA fra eggcellen. De første eksperimentene med overføring av kjerne ble gjort med frosker og salamandre. Da man klarte å lage kloner med denne metoden, viste man at voksne somatiske celler inneholder all den genetiske informasjonen som trengs for å skape hele organismen har evnen til å aktivere fosterutvikling kan glemme spesifikasjonene sine og oppføre seg som et totipotent (kapittel 9), befruktet egg Antifrost-bakterier Frost skader planter ved at iskrystaller dannes på bladene og bryter opp det levende vevet. Det viser seg at Pseudomonas syringae-bakterier spiller en Reproduktiv kloning Innebærer at man, etter overførig viktig rolle i denne prosessen: de har frost-proteiner som stimulerer krystallvekst. Ved å populere planter med P. syringae-bakterier der man har slettet DNAet som koder for av kjerne, lar den nye hybridcella vokse til et embryo som settes inn i en surrogatmor med det formål å lage en ny organisme. frost-proteinene, beskyttes plantene fra frostskader fordi de skadelige naturlige bakteriene utkonkurreres av de harmløse Terapeutisk kloning Innebærer at embryoet, i stedet genmodifiserte bakteriene. Samtidig brukes de ikke-genmanipulerte frostbakteriene til å produsere kunstig snø. De gros i bioreaktorer og ødelegges (antagelig for å gjøre frost-proteinene tilgjengelige i løsning). Dette øker snøproduksjonen med 45% og sparer energi som ellers ville blitt brukt på nedkjøling av naturlig for å implanteres i en surrogatmor, las vokse in vitro til en blastocyst. Så høster man cellene fra innsiden av blastocysten og overfører dem til et medium som fremmer vekst av visse typer celler (for eksempel muskel-, benmargeller nerveceller) med det hensyn å produsere vev som kan brukes i transplantasjoner. snø. Sauen Dolly Det første klonede pattedyret, født i Dolly ble laget med overføring av kjerne, der kjernen kom fra jurene til en voksen sau. Dolly var det ene vellykede forsøket ut av de 277 kloningsforsøkene som ble gjort, hvorav 29 forsøk nådde stadiet der man hadde et embryo som kunne overføres til en surrogatmor (men i alle andre tilfeller enn Dolly ble fostrene spontanabortert på et tidlig stadium). Et problem med voksne celler er at mye av genmaterialet er undertrykt (kapittel 4, Strategisk adaptasjon ). For å lage Dolly ble denne genblokkaden fjernet ved å 20