INutec NORSK UNDERVANNSTEKNOLOGISK SENTER A.S. Rapport nr: Revisjon nr: 0 Dato: Prosjekt nr:

Transkript

1 INutec NORSK UNDERVANNSTEKNOLOGISK SENTER A.S Postboks 6, 5034 Ytre Laksevåg. Telefon (05) Telex: nutec n. Telefax: (05) Rapport nr: Revisjon nr: 0 Dato: Prosjekt nr: Rapportens tittel: Kontrollert av :,/9 TRYKKENDRINGER - EKSKUR.SJONER Einar Thorsen Metode for gjentatt og langvarig bestemmelse av sirkulatoriske gassbobler hos frittgående rotte i trykkammer. Godkjent av : Brit K. Kambestad Kiientloppdragsgiver: Statoil, Norsk Hydro, Saga Petroleum Kiients/kontaktpersons referanse: C. Hordnes Arbeidet utført av: R Arvid Hope, Kåre Segadal, Harald Sundland Sammendrag: - Fornålet med hovedprosjektet er å fremskaffe ny viten om dykking og gassbobledannelse, og som kan muliggjøre romsligere ekskursjonsgrenser på en måte som ikke medfører risiko for helseskader. Dette oppnås gjennom eksperimentelle, operasjonelle og teoretiske studier hvor dekompresjonsrelaterte problemstillinger og hypoteser testes ved trykkvandringer på forskjellig dybde. Tilegnet kunnskap vil utgjøre et viktig redskap ved utarbeidelse av nye og sikrere prosedyrer. Et sentralt element i den hyperbar-fysiologiske forskningen ved NTJTEC/Universitetet i Bergen er en eksperimentell modell med våkne rotter, og hvor boblemengden kan bestemmes etter dekompresjon fra eksponering til forhøyet trykk. Forsøkene vil ofte være langvarige, og denne rapporten omhandler en videreutvikling av eksisterende modell slik at sirkulatoriske bobler nå kan registreres fra implantert Dopplerprobe over lang tid i fritt bevegelige dyr under trykk. Dyrene kan benyttes til gjentatte forsøk/eksponeringer. Samtykke til å utføre forsøk med levende dyr er klarert med ForsØksdyrutvalget ved Universitetet i Bergen. Emneord på engelsk : excursion decompression rat Doppler ultrasound gas bubbles Emneord på norsk: trykkvandring dekompresj on rotte Doppler ultralyd gassbobler ERKLÆRING VED FORDELING I I X Fri Distribusjon Graderingen gjelder til : Fri gitt av oppdragsgiver Frigitt pr ISBN: Antall Sider: U ibifflig tilllæ h NU1 må rpmi issnnst asi i sin inl&t

2 TRYKKENDRINGER - EKSKURSJONER Metode for gjentatt og langvarig bestemmelse av sirkulatoriske gassbobler hos frittgående rotte i trykkammer Arvid Hope, Kåre Segadal og Harald Sundland INNHOLD side i INNLEDNING 3 2 METODE ForsØksdyr - operasjoner Trykkammeret Registrering av intravenøse gassbobler 7 3 RESULTATER OG DISKUSJON 8 4 REFERANSER 12

3 3 INNLEDNING Formålet med hovedprosjektet er å fremskaffe ny viten om dykking og gassbobledannelse, og som kan muliggjøre romsligere ekskursjonsgrenser på en måte som ikke medfører risiko for helseskader. Dette oppnås gjennom eksperimentelle, operasjonelle og teoretiske studier hvor dekompresjonsrelaterte problemstillinger og hypoteser testes ved trykkvandringer på forskjellig dybde. Tilegnet kunnskap vil utgjøre et viktig redskap ved utarbeidelse av nye og sikrere prosedyrer. (Se Hope et al 1995 for en mer omfattende introduksjon til denne problemstilhingen). Som i annen basalfysiologisk forskning er det også innenfor området dekompresjon og gassbobledannelse vanlig å benytte matematiske modeller. Disse kan så benyttes til å beregne og forutsi forekomst av gassbobler under forskjellige gitte betingelser. Forutsetningen for at en slik modellbruk skal bli vellykket er at det foreligger gode eksperimentelle data som modellen kan kalibreres og/eller testes mot. For dekompresjon og gassboble-dannelse er denne problemstillingen særdeles gyldig, noe som ble sterkt understreket under et nylig arrangert symposium i Skottland ( Decompression Studies - Theoretical and Experimental. Getting the two together, Ballater, Skottland, november 1995). Behovet for flere, og bedre, eksperimentelle data ble understreket av flere deltakere. Denne rapporten omhandler en videreutvikhing av en etablert eksperimentell modell med våkne rotter (Bergø et al 1988, Hope og Sundland 1991, Hope et al 1994, Stuhr 1994) hvor sirkulatoriske bobler nå kan registreres fra implantert Dopplerprobe etter dekompresjon fra langvarig eksponering til forhøyet trykk i fritt bevegelige dyr. Resultater oppnådd med denne modellen vil kunne gi nyttig informasjon om bobledannelse ved trykkendringer; informasjon som også kan brukes i eksisterende matematiske modeller. Dyrene kan benyttes til gjentatte forsøk/eksponeringer, og forsøkene er idarert og godkjent av ForsØksdyrutvalget ved Universitetet i Bergen.

4 hentet fra dette arbeidet. detaljinformasjonen gitt i dette og neste kapittel (kap. 2.2 Trykkammeret) er derfor ForsØksoppsettet er tidligere beskrevet av Plahte (1995). Svært mye av 2.1 Forsøksdyr - operasjoner 2 METODE i slangeveggen. av en bit silikonslange som er snittet opp og hvor selve krystallen er innsydd Figur 1. Tegningen viser en rotte plassert i en plastsylinder med diameter 25 cm og høyde 30 cm. Probekabelens opphengningsmetode er skissert. Proben består Doppler-instiument Kabel til DØgnsyklus var 12 timer lys og 12 timer mørke. Det operative mngrepet ble foretatt operasjon ble dyrene holdt i bur med opp til 6 rotter i hvert; deretter i enkeitbur. Wistar hann-rotter, gjennomsnittsvekt ca. 280 gr, ble benyttet i alle forsøk. Før under anestesi gitt subcutant (Hypnorm-Dormicum, 1 mg/kg). Via et flankesnitt (under brystkassen mot ryggen på dyrets høyre sidj ble en ultralyd Dopplerprobe (DBF-120- krystallen er plassert i veggen på en kort bit av en tynnvegget silikonslange. Denne A-XS, 20MHz, Chrystal Biotec, USA) implantert på vena cava distalt for nyrene. Selve slangebiten utgjør selve proben som plasseres rundt vena cava og festes med to suturer for å lukke spalten i slangebiten (Figur 1). 4

5 De to tynne kablene fra proben ble ført fram under huden og loddet til en 9-pins hunnkjønn RS232 plugg som deretter ble festet med dentalsement (Paladur, Kultzer &Co GmbH) på toppen av kraniet. Skalletaket var først blottiagt med et 2,5 cm langt snitt og deretter vasket med fysiologisk saltvann. 5 På forsøksdagen ble den våkne rotten koblet til en hannkjønn RS232 plugg med fleksibel kabel til en svivelkontakt (Type Lehigh, Valley electronics, USA). Svivelen var festet silk at den hang sentrert over dyrets oppholdsbur (Figur 1). Doppler ultralydsignalene ble overført fra svivel-kontakten til en egen penetrator i kammerveggen. 2.2 Trvkkammeret Trykkammeret som ble benyttet har et innvendig volum på 130 liter og har et maksimalt arbeidstrykk på 150 bar. Kammeret ble konstruert av Christian Michelsens Institutt, Bergen og bygget ved Bergen Mekaniske Verksteder, Bergen i En detaljert teknisk beskrivelse av kammeret foreligger ved NUTEC i Rapport om Trykkammer Som det fremgår av Figur 2 er det 2 vinduer i kammeret; et lite på toppen (diameter 50 mm) og et større (120 mm) i kammerets ene ende. Vinduene benyttes til lyssetting, visuell observasjon og/eller videoovervåking. Gass til trykksetting overføres gjennom rør fra gassflasker som er plassert på utsiden av bygningen, og inn i trykkammeret via et gassblandingspanel med trykkreduksjons ventiler. Selve trykksettingen og reguleringen av trykk og oksygentensjonen styres av et egetutviklet dataprogram via ventiler i panelet. Dette styre-programmet er nærmere beskrevet tidligere (Værnes og Jellestad 1993). Inne i kammeret var det installert en trykktransducer (HAENNI Type EDR 411/314/211, 100 bar), en oksygencelle (Type C3 Middlesbrough, Cleveland, UK), en standard fuktighetssensor (HM2O, Vaisala, Finland) og en termistor for registrering av gasstemperaturen (Type 33AR LH35 CZ). Verdier for trykk, p0 relativ fuktighet og temperatur ble overført til en PC og lagret i denne (Værnes og Jellestad 1993). En ekstern paramagnetisk oksygenmåler (Servomex, SYBRON/Taylor, Cybron corp., England) ble benyttet i noen forsøk i tillegg til oksygencellen inne i kammeret for å kontrollere verdien avlest fra oksygencellen. Overensstemmelsen var god i disse forsøkene. 2, God blanding av kammeratmosfæren ble oppnådd ved hjelp av en børsteløs vifte

6 (Sprofona SJ-80Y12A, Seicoelectronics, Japan) montert inne i kammeret. Urinen ble samlet opp i sagmugg under buret og kammeratmosfæren ble renset for forurensinger ved at det var satt inn et begergiass med Sofnofil 613 (Molecular Products United Drug Co Ltd, Essex, UK). Det var ikke sjenerende lukt når kammeret ble åpnet etter 20 timer. To begergiass med CO2 absorbent (Sodasorb, Molecular Products United Drug Co Ltd, Essex, UK) var plassert i kammeret for absorpsjon av CO2 produsert av rotten. 6 Figur 2. Figuren viser et fotografi av kammeret med bl. a. kobberrør-vildingene (venstre side) og en prinsipptegning med med noen mål i mm (høyre side). Trykkammerets atmosfære ble oppvarmet ved hjelp av et vannbad med tilhørende pumpe (Hetrofrig CB7 og 03PF623, Hetro Lab. Equipment, Danmark) som leverte varmt vann (50 C) til kobberrør viklet tett rundt kammerets utside og innenfor et isolasj onslag. For å få ut nitrogenet i kammerluften ble en helioks gassblanding (79% helium og 21% oksygen) tilført forsiktig på toppen av kammeret samtidig som eksosrøret fra bunnen av kammeret var åpen. Prøver fra denne eksosgassen ble kontinuerlig målt på et massespektrometer (Centromc 200 MGA, Croydon, UK) til mtrogeninnholdet var mindre enn 0,1%. Trykkøkningen under denne gassutskiftningen ble begrenset til 5 kpa. Deretter ble kammeret trykksatt med den ønskelige gassblandingen som i våre forsøk var den samme 79/21% helioks-blandingen.

7 7 2.3 Registrering av intravense gassbobler IntravenØs bobleforekomst registreres ved hjelp av et ultralyd Doppler instrument (Alfred, Vingmed Sound). Dette instrumentet, og hvordan det kan benyttes til bobledetektering, er beskrevet i detalj tidligere (Brubakk et al 1982). Lydsignalene ble tatt opp på kassettspiller for evt. senere avspilling, og i tillegg skrevet ut i sann tid på en skriver (ORP 1200, Oscillographic recorder, Yokogawa, Japan). Figur 3 viser effekten av å filtrere ( 10w pass filter ) og kvadrere et typisk råsignal fra bobler registrert med dopplerproben på vena cava. Lydsignalene ble tatt opp på en høykvalitets kassettspiller og avspilt etter forsøk. Bearbeidingen av signalene er foretatt med en signalanalysator (Hewlett Packard, Dynamic Analyzer 3562A). Registreringen av bobleforekomst gjengitt i Figur 5 er også frenicommet etter en slik signalfiltrering og kvadrering. EE *,I+w 0 4 Sekunder 0 0,2 0,4 Sekunder 0 0,2 0,4 Sekunder Figur 3. Figuren viser hvordan et Doppler råsignal (Øverst til venstre) kan bearbeides ved hjelp av flitrering (Øverst til høyre) og kvadrering (nederst til venstre) med signal analysatoren til et signal som er lettere å tolke.

8 Det har vist seg at pluggen festet til kraniet (Figur 1) kan resultere i infeksjoner i dette og Sundland 1991, Hope et al 1994, Stuhr 1994, Bergø et al 1988). i detalj tidligere (Brubakk et al 1982, Butler et al 1991, Lm 1981, Lm et al 1984, Hope Selve teknikken og teorien for detektering av bevegelige gassbobler i blodstrømmen med Doppler ultralyd samt den eksperimentelle modellen med våkne rotter er beskrevet 3 RESULTATER OG DISKUSJON Typiske Doppler ukralyd-signaler slik de fremkommer på skriver etter filtrering og kvadrering er vist i Figur 5. Relativ fuktighet steg raskt de første 2-3 timene til 75% og flatet deretter noe av til en endelig verdi på 87%. I det aktuelle forsøket var kammeret forvarmet til 28 C. Den forutbestemte kammertemperaturen på 30 C ble nådd etter 3 timer og holdt seg konstant fuktighet falt de andre verdiene raskt tilbake til utgangsverdier etter dekompresjonen (Figur 4). på denne verdien under resten av den hyperbare perioden. Med unntak av relativ og eksosutslipp hvor trykket kunne endres til 181 kpa (8,1 meter) og 179 kpa. Som et samme gjelder for kammertemperaturen; Figur 4, Øverste panel). Også i de svært grunne i figuren, men er et resultat av at p02 ble angitt uten desimal i programmeringen. Det Data gjengitt i Figur 4 er fra et metningsdykk til 8 meter og viser at trykket var konstant lik 180 kpa med unntak av noen korte perioder med automatisk gassinjeksjon oksygen mellom 37 og 38 kpa (Figur 4). (Partialtrykket Økte ikke trinnvis som antydet resultat av forbruk og derpå følgende automatisk injeksjon varierte partialtrykket av eksponeringene på 3 meter var trykk og p02 tilnærmet konstant i hele perioden. gassene. Som det fremgår av Figur 4 var både trykk, partialtrykket av oksygen og Nitrogen- og karbondioksid-konsentrasjonen ble målt like etter dekompresjonen; d.v.s. etter 16 timers eksponering, og ved slutten av forsøket etter 20 timer i helioks temperatur tilnærmet konstant under den hyperbare eksponeringen. atmosfære. Kammeratmosfæren inneholdt fortsatt i underkant av 0,2% av begge disse forøvrig er hentet fra The Harvard Bioscience Whole Rat Catalog fra området slik at pluggen løsner og dyret må avlives. Vi vurderer derfor en enklere, og på mange måter sikrere løsning som vist i Figur C i Appendix. Figuren og informasjon 8

9 ,. I I $ I I Temp j30 *fr**-*_*- 4 * -*.*. * *. 31 Ç) 32 RH % -. 9 ( Prober og Dopplerinstrumentet ble testet i egne in vitro forsøk med luftbobler i vann Oppristing av springvann resulterte i dannelse av Ørsmå bobler som ga klare som sirkulerte gjennom en tynn plastsiange (Figur A i Appendix; fra Hope et al 1994). kpa; d.v.s et 8 meters dykk. Endringer i kammertemperatur og relativ fuktighet er gjengitt i Øverste panel, mens trykket (angitt som dybde i meter sjøvann) og partialtrykket av oksygen er vist i nederste panel. Figur 4. Resultatene i denne figuren er hentet fra et forsøk med trykkøkning til 180 Tki. tfmer Å 2 25 j4 E I. Trykk p E *

10 AogB). 1991). Figurer fra disse to arbeidene er tatt med som dokumentasjon i Appendix (Figur av boblekjerner for at større og skadelige bobler skal kunne utvikles. Det ble også Dopplersignaler når dette vannet sirkulerte i plastslangen. Oppristing av destifiert, ionebyttet vann ga imidlertid ikke opphav til slike detekterbare mikrobobler. Denne observasjonen kan være av interesse med tanke på diskusjonen omkring tilstedeværelse injisert gass i en femoralvene i flere dyr for å få bekreftet at Dopplersignalene fra proben på vena cava virkelig skyldes gassbobler som passerer denne (Hope og Sundland modell i dekompresjonsforskning. Til det er å si følgende: For det første er opptak og fjerning av løst inertgass i perifere og bobledannende vev som muskulatur, hud, fettvev, bindevev o.a kvalitativt sammenlignbare med det vi finner hos mennesket og andre I forskjellige fora blir det fra tid til annen diskutert om rotte er en relevant og brukbar Metoden beskrevet ovenfor ble deretter benyttet til forsøk med 8 dyr som, i randomisert rekkefølge, ble lrykksatt på helioks pustegass til 130, 150 og 180 kpa i 16 timer (Figur nærmere beskrevet i Hope et al 1995). D i Appendix). Deretter ble hurtig dekompresjon foretatt (ca. 30 sek) og registrering av evt. venøse gassbobler ble gjennomført i de følgende 4 timene. (Disse forsøkene er bobler. I nederste panel er vist en periode (2 timer og 15 min etter øverste registrering er fra en periode hvor rotten ligger i ro uten forekomst av Figur 5. Doppler-registrering etter dekompresjon fra helioks metning til 180 kpa. dekompresjonen) med mye bobler og hvor rotten også ligger helt i ro. Enkeitsignalet merket med B er sannsynligvis fra en stor enkeltboble. 10 B j 10 sekunder I i I. i li Ii I,ihJi lii, L Ji

11 landlevende pattedyr som gris, hund, katt, kanin, geit etc. For det andre gir litteraturen holdepunkter for at mekanismene og betingelsene for bobledannelse i slike vev og perifere blodkar er de samme i disse forskjellige pattedyrene; inkludert mennesket. For det tredje er rotte et svært mye benyttet forsøksdyr til studier av sirkulasjonssystemet, både under normale forhold men også under eksperimentelle betingelser som ved forhøyet trykk. Vi tar dessuten ikke sikte på å bestemme symptomer på trykkfallsyke i våre forsøk. (Rotte, og for den saks skyld andre forsøksdyr, er ganske sikkert ikke noen god modell når det gjelder forekomst av slike symptomer). 11 Det konkluderes med at dyremodellen med implantert Doppler-probe på vena cava hos rotte nå er videreutvildet slik at gjentatte og langvarige forsøk under Økt trykk og med forskjellige pustegassblandinger kan foretaes i fritt bevegelige dyr. Vi har fått mye god hjelp i planleggingen og gjennomføringen av forsøkene. Spesielt vil vi få takke Finn Jellestad, Gerd Solvesen og Ragnar Værnes for praktisk hjelp og gode råd på laboratoriet; Knut A ukland for hans interesse og faglige råd; Ingvald Tyssebotn og hans medarbeidereforgodfaglig støtte og for aldri å si nei i denne viktige innledende fasen av prosjektet, og Brit K. Kam bestod og Einar Thorsen for hjelp til den statistiske evalueringen av resultatene. Det har også vært flere nyttige tips og kommentarer å hente på fagmøtene i OMEGA -prosjektet med representanter fra bidragsytere og andre prosjekimedarbeidere fra SINTEF UNIMED, UNIT, UiB og NUTEC.

12 Bergø GW, Risberg J, Tyssebom I. Effect of 5 bar oxygen on cardiac output and organ blood flow in conscious rats. Undersea Biomed Res 1988; 15: Brubakk AO, Grip A, Holand B, Dawson R, TØnjum S. Ultrasound doppler measurement of circulatory changes and circulating bubbies during Deep Ex II. Butler BD, Robinson R, Fife C, Sutton C. Doppler detection of decompression bubbles NUTEC Report No , REFERANSER Værnes RJ, Jellestad FK. Årsak til høytrykksnervesyndromet. Årsrapport NUTEC Rapport nr , Stuhr LEB. Deteksjon av intravaskulære gassbobler med ultralyd i våkne roller etter ekskursjoner fra metningsdykk. Rapport Universitetet i Bergen, Fysiologisk institutt, til 0,2 atm abs. Hovedfagsoppgave, Fysiologisk institutt, Universitetet i Bergen Plahte FM. En vurdering av effekten på HPNS symptomer ved å redusere p0 2 fra 0,6 Lin YC, Mack GW, Watanabe DK, Shida KK. Experimental attempts to influence the bubbie threshold from saturation dives in animals. In: AJ Bachrach and MM Matzen Maryland, 1984; pp (eds.) Proceedings of the eighth symposium on underwater physiology. Bethesda, symposium on underwater physiology. Bethesda, Maryland, 1981; pp699-7o6. Lin YC. Species independent maximum no-bubbie pressure reduction from saturation dive. In: AJ Bachrach and MM Matzen (eds.) Proceedings on the seventh Registrering av gassbobler i våkne, fritt bevegelige rotter etter hurtig dekompresjon fra 16 timers grunn metning i helioks-atmosfære. NUTEC Rapport nr , Hope A, Segadal K, Sundland H. TRYKKENDRINGER - EKSKURSJONER. Registrering av intravaskulære gassbobler i fritt bevegelige rotter. NUTEC Rapport Hope A, Segadal K, Sundland H. TRYKKENDRINGER - Nr , EKSKURSJONER. hos rotte. NUTEC Rapport Nr , Hope A, Sundland HA. Etablering av metoder for måling av intravaskulære gassbobler 62: , with computer assisted digitization of ultrasonic signals. Aviat Space Environ Med 12

13 APPENDIX

14 Figurene A og B i dette Appendix viser Dopplersignaler fra in vitro forsøk og etter intravenøs injeksjon av gassbobler. Målingene utgjør en viktig dokumentasjon på at de registrerte dopplersignalene observert under dekompresjonsforsøk skyldes forekomst av gassbobler. Doppler instrument Tzykkluft Boblestein Figur A. Tegningen viser et oppsett for produksjon og registrering av bevegelige gassbobler i vann. Gassboblene, som produseres i karet til høyre og beveger seg med vannstrømmen i slangen til det venstre karet, registreres med henholdsvis probe rundt slangen ( ekstravaskulær plassering; jfr. Figur 1) eller med krystallen i selve vannstrømmen ( intravaskulær plassering). (Figuren er fra Hope et al. 1994).

15 f i sek -j A c D E F Figur B. Registrering av bobler avspilt fra båndspiller etter forsøk. øverste panel viser signaler fra in vitro-produserte bobler (jfr. Figur A i dette Appendix). De 2 signalene ved A og B stammer fra små bobler (visuelt observert), mens C er dopplersignal fra en stor boble m fylte hele tverrsnittet av plastslangen. I midire panel er vist flere in vivo-produserte bobler registrert i vena cava. Signalene i nederste panel fremkom etter infusjon av henholdsvis to små (D og E) og en stor boble (F) i lårvenen. Dopplerregistreringen var fortsatt fra vena cava.

16 I tether I Som figuren også viser ble det foretatt bobledetektering med doppler ultralyd Figur D. ifiustrasjon av trykk/tid proffier for tre metningsdykk av 16 timers varighet. Tid (timer) tekst side 4 og Figur 1). Figuren og informasjon om denne løsningen er Figur C. Figuren viser en antatt bedre metode for festing av den fleksible kabelen (jfr. hentet fra The Harvard Bioscience Whole Rat Catalog fra swivel i 30 minutter før trykksetting, i 30 minutter før start dekompresjon og deretter i 4 timer ved normalt atmosfærisk trykk (fra Hope et al 1995) A B G I I I I I I I Bobledete1c1ring - kpa