HOVEDPROSJEKTER VED KJEMILINJEN VÅREN 2005

Transkript

1 HOVEDPROSJEKTER VED KJEMILINJEN VÅREN 2005

2 1. Ekspresjon og rensing av humant Ape2 I forbindelse med forskning på reparasjonsmekanismer for DNA, er det isolert og identifisert AP endonukleaser. Disse klassifiseres i to hovedgrupper etter E. coli proteinene exonuclease III og endonuclease IV. I mennesker er den viktigste abasiske endonukleasen Ape1, en ExoIII homolog. Et annet humant enzym, Ape2, har også blitt identifisert, og dette inneholder aminosyresekvenser som likner kjerne nukleasedomenet i Ape1 og ExoIII. Det er imidlertid markerte forskjeller mellom enzymene. Det har vist seg vanskelig å uttrykke og rense Ape2 proteinet. Dette proteinet består av 518 aminosyrer og innholder flere ulike domener, i tillegg til AP endonuklease domenet. Man antar at det også er et PCNA-bindende område i C-terminal regionen i Ape2, og det har vært vist at enzymet bindes til PCNA. Vi har ikke klart å uttrykke Ape2 i bakteriesystemer som gjør oss i stand til å rense tilstrekkelige mengder protein for å gjennomføre en detaljert biokjemisk karakterisering av enzymet. Rapporter tyder på at det ofte er nødvendig å uttrykke to eller flere gen samtidig (coekspresjon) for å oppnå optimal mengde, løselighet og aktivitet. Co-ekspresjon av multiple proteiner i E. coli kan oppnås ved å bruke enkelt vektorer som bærer to eller flere gen, eller ved å bruke flere vektorer med hvert sitt genområde innsatt.vi vil forsøke en dobbelt genekspresjon av Ape2 og PCNA i samme vektor for å uttrykke og rense enzymet. Oppgaven utføres ved: Rikshospitalet, Molekylærbiologisk seksjon Studenter: Elin Eide og Rita Sørensen Ekstern veileder: Luisa Luna 2. Kvantitativ multipleks PCR for bestemmelse av cystisk fibrosegen Matforsk har utviklet en ny multipleks kvantitativ DNA array basert PCR metode (MQDA- PCR). Denne metoden er generell og kan brukes i alle områder innen biologisk forskning hvor det er ønskelig å kunne påvise og kvantifisere multiple genområder samtidig. Metoden baserer seg på en totrinns PCR. I det første trinnet utføres noen få sykluser hvor det benyttes primere som inneholder en universell 5`HEAD region og en 3`region som er spesifikk for hver av genområdene. Dette fører til oppkonsentrering av nye DNA områder med like ender. Deretter degraderes ubrukte primere med en enkelt trådet DNA spesifikk exonuklease. I det andre trinnet benyttes primere som kun bindes til de like områdene i den universelle HEAD regionen. Alle de ulike gensekvensene oppkonsentreres dermed. For å påvise hvilke gensekvenser og hvilke mulige mutasjoner som disse har i seg, blir PCR produktene blottet over på nylonfiltre eller glassplater. Der blir de hybridisert med ulike oligonuleotidprober,

3 som er merket. Påvisning av hvilke prober som bindes blir gjort i en såkalt DNA array metode som tillater multipleks påvisning. Matforsk har tidligere brukt kvantifisering av transgene mais i mat og fòr som et modell system for å vise metodens anvendbarhet. I dette hovedprosjektet ønsker vi å vise at metoden kan benyttes til å påvise mutasjoner i gen som er ansvarlig for cystisk fibrose. Den vil da være et viktig verktøy innen klinisk diagnostikk. Primere og prober tilknyttet de ulike mutasjonene vil bli designet og testet. For å optimalisere systemet vil PCR og merkereaksjonene bli utført under ulike betingelser. Prefererte merkete prober vil bli påvist ved bruk av kapillærelektroforese. Oppgaven utføres ved: Matforsk, Ås Studenter: Rita Ringstad og Rachmilla Andersen Ekstern veileder: Askild Holck 3. Kloning og ekspresjonsstudier av fosfoenolpyruvat-karboksykinase (PEPCK) hos Nil Tilapia Akvaforsk ble invitert av organisasjoner innen FN til å jobbe med oppdrett av Tilapia, en fisk som benyttes mye til oppdrett i Asia. I denne forbindelse gjennomføres et fòringsprosjekt i regi av Akvaforsk og Universitetet for miljø- og biovitenskap (UMB) som går ut på å undersøke effekten av å erstatte vegetabilsk protein med bakteriell biomasse i fiskefôret. Blant annet kan denne overgangen føre til påvirkning av mengden PEPCK som dannes i fisken. Dette enzymet er aktivt i den metabolske prosessen som kalles glukoneogenesen hvor glukose blir syntetisert. Oppgaven går ut på å se på hvordan mengde enzym dannet påvirkes ved ulike fòringsmetoder. Metodene som benyttes er molekyler genetiske og omfatter isolering av mrna fra ulike fiskevev, syntese av cdna, PCR av bestemte fragmenter av DNA, blant annet ved real time PCR, og sekvensering av DNA fragmentene. Oppgaven utføres ved: Akvaforsk, NLH, Ås Studenter: Elisabeth Andersen og Chadia El Kadi Ekstern veileder: Øyvind Andersen 4. Undersøkelse av stabiliteten av nedregulering av FEN1 proteinekspresjon. Cellene utsettes kontinuerlig for endogene og eksogene agens som kan føre til DNA-skader. Skadene kan føre til mutasjoner og kreft dersom de ikke repareres. Oksidative og alkylerende skader er de vanligste og repareres som regel ved baseutkuttingsreparasjon. For å studere in vivo rollen til et DNA reparasjonsenzym, kan man benytte ulike teknikker, så som knock-out mus (hvor hele genet er borte), knock-in mus (hvor genet er mutert), eller ved RNA interference (RNAi) teknikk i celler. Den sistnevnte teknikken skal benyttes i denne oppgaven. HeLa celler og HeLa celler hvor et DNA reparasjonsgen, Flap Endonuklease 1 (Fen-1), er nedregulert vha RNAi-teknikk, skal undersøkes for grad av nedregulering av utrykket av FEN-1, samt hvor stabil denne nedreguleringen er. Det skal også undersøkes om graden av nedregulering er ulik i ulike cellekloner. For å gjøre dette, vil flere ulike teknikker,

4 så som isolering av RNA og Nothern blotting, isolering av protein og Western blotting, samt isolering av DNA og Southern blotting benyttes. Det vil også være nødvendig å lære humant celledyrkingsarbeid. Oppgaven utføres ved: Center for Molecular Biology and Neurosciences (CMBN), og Institutt for Medisinske Basalfag, Avdeling for ernæringsvitenskap Studenter: Isabel Husebæk og Linn Wilhelmsen Ekstern veileder: Dr. Trine Johansen Meza og Professor Arne Klungland. 6. Mikrobiologisk analyser ved malingsproduksjonen ved Jotun fabrikker Vannbasert maling kan forurenses av mikroorganismer som degraderer flere av komponentene i malingen og fører til forringelse av kvaliteten. Jotun fabrikker har et eget biologilaboratorium som kontrollerer maling og produksjonsutstyr. Ved dette laboratoriet er følgende forsøk planlagt: * Hvilket substrat er optimalt for hygienisk kvalitetskontroll av produksjonsutstyr, råstoffer og ferdig vannfortynnbar maling? Alternativer kan bl.a. være: Næringsagar fra Merck Næringsagar fra Fluka Standard 1-næringsagar, Merck Kan evt. også sammenlignes med GPM-plus buljongmedium for bakterietest i Bactometer (impedansmåler fra biomerieux) og / eller Pseudomonasagar fra Oxoid. * Vurdering av alternativ substratsammensetning for deteksjon av mikroorganismer (primært mugg- og gjærsopp) fra vannfortynnbar maling og malingråstoffer i Bactometer (impedansmåler fra biomerieux). Ved hygienisk kvalitetskontroll forekommer i noen prøver mikroorganismer (oftest gjærsopp), som ikke detekteres i nåværende buljongmedium, YMB, men som kan dyrkes på maltekstraktagar (Merck). Oppgaven utføres ved: Jotun, Sandefjord Studenter: Janne Einbu og Lillann Rosland Ekstern veileder: Bodil Schmidt 7. Effekt av temperatur og lagringstid på DNA ekstrahert fra fullblod For å studere sammenhengen mellom genetisk variasjon og forekomst av sykdom, oppretter man ofte biobanker hvor man samler inn biologisk materiale fra et stort antall individer. Den norske Mor og barn undersøkelsen (MoBa) er en biobank i regi av Nasjonalt Folkehelseinstitutt. Dette er en landsomfattende undersøkelse som skal følge barn fra fosterlivet til voksen alder. Hensikten er å finne årsaker til alvorlige

5 sykdommer. Rekrutteringen til undersøkelsen skjer i samarbeid med fødeavdelingene ved sykehusene. ( gå under store studier og trykk på Mor og Barn undersøkelsen) Fullblod er den mest benyttede kilden ved isolering av DNA. Ved innsamling av fullblod fra deltakerne i MoBa studien er man avhengig av at arvematerialet som isoleres fra blodprøvene er av god kvalitet og kvantitet. Dette forutsetter at blodprøvetaking, transport av blodprøvene, og lagring av prøvematerialet er så optimal som mulig. Både prøvetakingsmetode og lagringsprosedyrer er derfor viktig for å kunne undersøke arvematerialet i fremtiden. MoBa studien er en multisenter studie, og blodprøver fra deltakerne i studien blir samlet ved fødeavdelinger på sykehus og fødestuer i hele Norge. Norge er ett langstrakt land med 4 års tider. Dette medfører ulik transporttid for blodprøvene avhengig av hvor i landet de sendes fra. Blodprøvene vil videre kunne bli utsatt for store temperatursvigninger som følge av årstidsvariasjoner. Hensikten med dette prosjektet er derfor å undersøke effekten av ulik lagringstid (tid fra blodprøvetaking til DNA ekstraksjon) og ulik lagringstemperaturer på kvalitet og kvantitet på ekstrahert genomisk DNA. PCR benyttes for å oppamplifisere ønskede DNA sekvenser. Før man kan benytte denne teknikken, må DNA fra prøvematerialet man ønsker å undersøke isoleres. I dette prosjektet vil studenten(e) innhente blodprøver, og. DNA fra prøvematerialet ekstraheres ved hjelp av et kommersielt kit. Analyser vil så utføres på det oppnådde arvematerialet. For å verifisere kvaliteten på det oppnådde arvematerialet, vil genteknologiske metoder som PCR, kutting med restriksjonsenzymer, og gelelektroforese benyttes. Videre vil studenten(e) måle renheten og konsentrasjonen på arvematerialet spektrofotometrisk. Oppgaven utføres ved: Folkehelseinstituttet Studenter: Therese Marthinsen og Tone Stenstadvold Ekstern veileder: Kjersti Skjold Rønningen, Anita Haugan, Jeanette Aarem Intern veileder: Kirsten Aarset 8. Evaluere kvantitativ og kvalitativ PCR for påvisning av parvovirus B19 i serum Bakgrunn Parvovirus B19 er et enkelttrådet DNA-virus som blant annet forårsaker femte barnesykdom (eythema infectiosum). De fleste gjennomgår en ukomplisert infeksjon med dette viruset i løpet av barneårene, men infeksjon kan også forårsake mer alvorlig sykdom: Leddsykdom hos voksne Forbigående alvorlig anemi hos personer med arvelige defekter i de røde blodlegemene Vedvarende anemi hos personer med visse immundefekter Alvorlig fostersykdom med hjertesvikt, leversvikt og eventuelt død Problem Infeksjon med Parvovirus B19 diagnostiseres ved antistoffmålinger i serum eller ved å påvise virusets DNA i ulike kroppsvæsker (blod, serum, benmarg, leddvæske, fostervann). Ved

6 Nasjonalt Folkehelseinstitutt, Avdeling for infeksjoner som smitter via luftveiene, enhet for virologi (SMAL-VI), utføres serologiske undersøkelser samt kvalitativ PCR. Studier har vist at virusets arvemateriale (DNA) av og til kan påvises i små mengder i serum i lang tid (måneder eller til og med år) etter gjennomgått infeksjon. Det kan derfor være nødvendig å kvantitere mengden av virus i serum for å kunne vurdere om funn av viralt DNA i serum er relevant i forhold til aktuelt sykdomsbildet. Ved SMAL-VI holder vi på å etablere en kommersielt utviklet kvantitativ real-time PCR, og har på sikt planer om også å etablere en in-house metode for dette. Deler av dette arbeidet med utvikling og etablering er velegnet som studentoppgave. Oppgaven kommer til å omfatte følgende: Danne standardkurver ved å analysere prøver med kjent mengde viralt parvovirus B19-genom Kvantitere mengden viralt DNA i sera der det tidligere er påvist parvovirus B19- genom kvalitativt Utføre kvantitativ analyse på et sett med prøver der serologiske analyser har gitt holdepunkt for aktuell infeksjon med parvovirus B19 Eventuelt sekvensere positive prøver med tanke på å avdekke hvilke genotyper som foreligger Oppgaven utføres ved: Avdeling for infeksjoner som smitter via luftveier, Divisjon for smittevern: Nasjonalt Folkehelseinstitutt Studenter: Mona Milde og Anita Åsebø Ekstern veileder: Dr. scient Kirsti Vainio Intern veileder: Høgskolelektor Bente Hellum 9. Kvantitativ bestemmelse av cellulære komponenter med immunoblotting. Bakgrunn: Som en del av et større prosjekt med å kartlegge kommunikasjon mellom naboceller, brukes en metode som innebærer bruk av antistoff og billedanalyse. Antistoffer brukes i ulike teknikker til å bestemme mengde, lokalisering og egenskaper til cellulære proteiner. Oppgaven går ut på å vurdere ulike problemstillinger knyttet til kvantitative bestemmelser ved hjelp av Westernblot og Slotblot. Oppgaven er tenkt gjennomført ved å eksponere tre ulike celletyper i kultur for økende konsentrasjon av ett eller flere modellkjemikalier. Mengde av en spesifikk komponent i ekstrakter fra disse cellene blir så visualisert ved hjelp av Western og Slot blot og kvantitert ved hjelp av billedanalyse. Variasjon og linearitet i resultatene vurderes nøye for å gi det optimale kvantitative resultat. Forsøkene vil gi erfaring i celledyrking, elektroforese, immunoblotting teknikker og billedanalyse. Oppgaven utføres ved : Avdeling for Miljø og Yrkesbetinget Kreft, Institutt for Kreftforskning, Radiumhospitalet, Studenter: Siren Troland og Ali Tirna Eksterne veiledere: Avdelingsingeniør Astri Nordah og Seniorforsker Edgar Rivedal Intern veileder: Høgskolelektor Bente Hellum

7 10. Bruk av DNA microarray analyser for å forstå sammenhengen mellom tarmflora og utvikling av allergi hos spedbarn Bakgrunn: Arbeidet vil være del av et større prosjekt "Ren Pen og Allergisk" som er et samarbeide mellom Folkehelse instituttet, Ullevål sykehus, og Fredrikstad sykehus. Som grunnlag for prosjektet er det allerede påvist en sammenheng mellom utvikling av allergi og fødsel med keisersnitt. Vår arbeidshypotese er at utvikling av allergi henger sammen med mangel av bakterier som barnet ville fått fra moren gjennom en normal fødsel, eller ved kolonisering med "feil" bakterier ved keisersnitt-fødsel. Vi ønsker å bruke DNA microarray teknologi for å sammenligne tarmflora hos spedbarn født med keisersnitt med spedbarn som er født vaginalt. Disse resultatene vil senere bli korrelert til om barnet utvikler allergi eller ikke. I tillegg til DNA array analyser vil vi bruke PCR, DNA sekvensering, slektskapsanalyse og andre standard DNA teknikker. Oppgaven utføres ved Matforsk, Osloveien 1, 1430 Ås Studenter: Ida Johansson og Lasse Fredriksen Ekstern veileder: Dr. scient Knut Rudi Intern veileder: Høgskolelektor Bente Hellum 11. Utvikling av nye applikasjoner for chlamcap med spesielt fokus på L. monocytogenes fra mat og kliniske prøver. Bakgrunn: Genpoint AS er et lite bioteknologiselskap, etablert i 1998, som arbeider med å utvikle nukleinsyrebaserte tester for påvisning av bakterier i fødemidler og kliniske prøver. Selskapet har for øyeblikket to hovedprodukter ute på markedet, BUGS n BEADS for isolering av et bredt spekter av bakterier, og chlamcap som er utviklet for isolering av Chlamydia trachomatis fra urinprøver. Dette systemet er nå i rutinebruk på Ullevål sykehus. ChlamCAP systemet har imidlertid potensialet til å fungere også på andre arter og i andre type prøver. Hovedmålet med dette prosjektet blir derfor å teste chlamcap på andre bakterier, først og fremst Listeria monocytogenes men også andre arter kan bli aktuelle. Listeria monocytogenes er en alvorlig matpatogen som spesielt forekommer i ost og fisk. Dødeligheten ved infeksjon av denne bakterien er relativt høy, og myndigheter i alle vestlige land har derfor svært strenge krav i forhold til L. monocytogenes. I motsetning til de fleste andre matpatogener, kan denne bakterien forårsake meningitt. I dette prosjektet vil derfor chlamcap systemet bli testet både på ost og fisk samt spinalvæske. Oppgaven utføres ved. GENPOINT AS, Kjelsåsveien 174, 0884 Oslo Studenter: Therese Østereng og Marie Kjølstad Ekstern veileder: Seniorforsker Unn Refstad Intern veileder: Høgskolelektor Bente Hellum

8 13. Analyse av glassfragmenter/glasstyper i forbindelse med åstedsbestemmelse Oppgaven vil gå ut på å bestemme identitet/merke og egenskaper til ulike typer glass- og glassfragmenter ved bruk av fysikalsk-kjemiske metoder (eksempelvis elementanalyse, elektronmikroskopi, brytningsindeksmålinger). En database skal bygges opp. Resultatene er tenkt brukt i forbindelse med åstedsbestemmelser. Sted: Kripos kjemiavsnittet Studenter: Silje Myhr og Mariwan Omer Ekstern veileder: Knut Endre Sjåstad Intern veileder: Per Ola Rønning 14. Analyse av bromerte flammehemmere i ferskvannsfisk Bakgrunnen for prosjektet er de høye nivåene av bromerte flammehemmere som tidligere er påvist i fisk fra Mjøsa. I denne forbindelse har det blitt samlet inn nye fiskeprøver fra Mjøsa, hvor man nå ønsker å se på hvordan de bromerte flammehemmerne fordeler seg i ulike organer (hjerte, hjerne lever osv.) Det har blitt har hentet prøver fra fisk som er gyteferdige, fisk utenom gytesesongen og fisk som ikke er spesielt høyt eksponert (fra Losna ovenfor Hunderfossen). Dette er gjort for å kunne ha et sammenlikningsgrunnlag ettersom man antar at gyteferdig fisk kan ha en annen fordeling av miljøgiftene i kroppen enn fisk utenom gytesesongen. Gyteferdig fisk er mer utmagret og fettløselige forbindelser har en tendens til å søke til fettrike vevstyper, som for eksempel hjerne og lever. Dette kan ha toksikologiske konsekvenser. Oppgaven blir å opparbeide prøver for analyse på GC-MS. Metodene blir primært homogenisering av vev, ekstraksjon og opprensning fulgt av analyse og kvantifisering. Prøvene skal primært analyseres på høyoppløselig MS, men for at studentene selv også skal kunne få analyse- og kvantifiseringsinnføring vil noen av prøvene også bli opparbeidet for lavoppløselig GC-MS. De to metodene vil deretter bli sammenliknet for å se om de gir forskjellige resultater. Oppgaven er absolutt interessant og nyttig, Oppgaven medfører en del laboratoriearbeid, men tid vil også bli avsatt til bearbeiding og tolkning av resultater. Det er ønskelig om studentene kan avsette noen dager før jul til registrering og organisering av oppstart samt litt rask innføring i problemstillingene. Sted: Norsk institutt for luftforskning NILU Studenter: Jonas Berntzen og Eva Lüdemann Ekstern veileder: Forsker Espen Mariussen Intern veileder: Per Ola Rønning 16. Analyse av aminosyren karboksyglutaminsyre i urin og blodprøver Vitamin K er muligens det minst kjente av alle vitaminene. Den biokjemiske virkningsmekanismen er å delta i omdannelsen av aminosyren glutaminsyre til γ- karboksyglutaminsyre. Dette skjer når glutaminsyren er koblet til andre aminosyrer i forskjellige proteiner. Når proteinet nedbrytes, frigjøres karboksyglutaminsyre og den

9 utskilles i urinen. Karboksyglutaminsyre finnes i enzymene som får blødninger til å stanse, og dessuten i benvev, blodårevegger, brusk, hjerne, bukspyttkjertel og øye. Oppgaven går ut på å bruke en kapillær-elektroforese-metode med laserindusert fluorescens til å påvise og måle aminosyren i blant annet urin og blodplasma (Analytical Chemistry 1999; 71: ). Før analysen må det lages et fluorescerende derivat. En del av utviklingsarbeidet vil derfor gå på å prøve ut mulige derivatiseringsreagenser og etablere en prosedyre for å gjennomføre derivatiseringen. Karboksyglutaminsyre måles i dag ikke i Norge, men den kan ha interesse i utredningen av mulig mangel på vitamin K. Det kan videre bli aktuelt i diagnostisk øyemed å utføre analysene på plasmaprøver fra pasienter med nyresvikt. Sted: Klinisk-kjemisk avdeling / Institutt for klinisk biokjemi ved Rikshospitalet. Studenter: Dana Rango og Johnny Ahmad Ekstern veileder: Overlege, dr. med. Gaut Gadeholt Intern veileder: Per Ola Rønning 17. Metodeutvikling av analyse av nytt kontrastmiddel med HPLC-DAD. Metode må optimaliser mhp god nok separasjon mellom produkt, reagenser og forurensninger. Metoden må også ha god nok følsomhet, spesielt mhp forurensningene. Parametere som må testes: i) kolonner ii) mobilfaser iii) scan- deteksjon for å se på renhet av "toppene" Oppgaven utføres ved. GE Healthcare, Chemical Development, Separation processes Studenter: Anabel Rosland og Chi Ko Tang Ekstern veileder: Marianne Fresvig, forsker Intern veileder: Hanne Thomassen