(12) Oversettelse av europeisk patentskrift

Transkript

1 NO/EP (12) Oversettelse av europeisk patentskrift (11) NO/EP B1 (19) NO NORGE (1) Int Cl. G01N 33/0 (06.01) Patentstyret (21) Oversettelse publisert (80) Dato for Den Europeiske Patentmyndighets publisering av det meddelte patentet (86) Europeisk søknadsnr (86) Europeisk innleveringsdag (87) Den europeiske søknadens Publiseringsdato () Prioritet , US, P (84) Utpekte stater AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO SE SI SK SM TR (73) Innehaver Entomopharm APS, Lundekaersvej 33, Odense SV, DK-Danmark (72) Oppfinner AADAL NIELSEN, Peter, Lergodsvaegen 1Q, S Oxie, SE-Sverige ANDERSSON, Gunnar, Per Gummessons Vaeg 1, S Roestaanga, SE- Sverige (74) Fullmektig Zacco Norway AS, Postboks 03 Vika, 012 OSLO, Norge (4) Benevnelse FREMGANGSMÅTER FOR SCREENING SOM BENYTTER INSEKTER MED BLOD-HJERNE- BARRIERE (6) Anførte publikasjoner KHAN N A ET AL: "Novel model to study virulence determinants of Escherichia coli K1" INFECTION AND IMMUNITY, vol. 7, no. 12, December 07 (07-12), pages , XP MARSH J L ET AL: "Drosophila in the study of neurodegenerative disease" NEURON, vol. 2, no. 1, October 06 (06--0), pages , XP cited in the application SARANTSEVA S V ET AL: "PROTEIN TRANSDUCTION DOMAIN PEPTIDE MEDIATES DELIVERY TO THE BRAIN VIA THE BLOOD-BRAIN BARRIER IN DROSOPHILA MELANOGASTER" BIOCHEMISTRY (MOSCOW) SUPPL SERIES B: BIOMEDICAL CHEMISTRY, vol. 3, no. 2, 1 June 09 ( ), pages 149-1, XP00273

2 NO/EP FREMGANGSMÅTER FOR SCREENING SOM BENYTTER INSEKTER MED BLOD-HJERNE-BARRIERE OPPFINNELSENS OMRÅDE 1 Den foreliggende oppfinnelsen er rettet mot insektmodeller som tar sikte på å gjenspeile penetrasjon av blod-hjerne-barrieren (blood-brain barrier, BBB) hos virveldyr. Undersøkelse av BBB-penetrasjon er ekstremt viktig i legemiddelutvikling; vellykkede SNS-legemidler må krysse blod-hjernebarrieren, mens BBB-penetrasjon kan forårsake uønskede bivirkninger for perifert virkende legemidler. Spesifikt vedrører den foreliggende oppfinnelsen anvendelsen av insekter ved screening for stoffer med en biologisk effekt på hjernen eller sentralnervesystemet og/eller effekt på en sykdom eller forstyrrelse i hjernen eller sentralnervesystemet. Den vedrører videre anvendelse av slike insekter i screening etter stoffer som har en ønsket biologisk aktivitet og som ikke krysser blod-hjerne-barrieren. BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN 2 3 Legemiddelutvikling er en kostbar affære, hvor in vivo-studiene er én av de største utgiftene med hensyn til tid og penger. For å redusere disse kostnadene er et stort antall in vitro-modeller utviklet og anvendt som filtre for å velge de mest egnede forbindelsene for in vivo-studier. In vitro-modeller er imidlertid ofte for forenklede og kan som sådan være villedende i beslutningsprosessen. Det er dermed en forespørsel etter mellommodeller som er mer pålitelige enn in vitromodeller og samtidig raskere og rimeligere enn tradisjonelle in vivo-modeller med virveldyr. Insekter kan ha denne funksjonen, og fruktfluer anvendes for tiden som farmakodynamiske (FD) mellommodeller av EnVivo Pharmaceuticals Inc., som utvikler SNS-legemidler. Det finnes ulike problemer med eksisterende in vitro-testing. Det er umulig å kjøre in vitro-assayer for å redegjøre for alle biologiske hendelser som forekommer in vivo. Det finnes biologiske hendelser som enda ikke er forstått eller svakheter ved de eksisterende in vitro-assayene, f.eks. kan assayene mangle viktige trekk som er tilstedeværende in vivo, inkludert aktive

3 NO/EP transportmolekyler, metabolske enzymer eller endog uforutsette biologiske hendelser. På tross av de åpenbare svakhetene anvendes in vitro-modellene i stor utstrekning i legemiddelutviklingsprosessen hvor de fleste farmasøytiske selskaper anvender store serier av in vitro-forsøk. Testing av forbindelser i et stort antall in vitro-assayer gjenspeiler kanskje ikke alltid atferden in vivo. Det er faktisk ikke uvanlig at forbindelser som har akseptable in vitro-profiler, viser seg å ha utilstrekkelige in vivo-profiler. På den annen side kan det hende at forbindelser kastes av gale grunner. Således er det et krav om in vitro-/in vivomellommodeller, som vil kunne støtte legemiddelutviklingsforskningen med forbedrede data og med dette redusere antallet kostbare in vivo-forsøk. 1 In vitro-modeller anvendes med antagelsen om at hver av modellene gjenspeiler én enkelt og isolert biologisk in vivo-hendelse. Det store antallet in vitromodeller som anvendes i utviklingsfasen (Ruiz-Garcia et al. 07) har imidlertid til hensikt å gjenspeile in vivo-biologiens kompleksitet, hvor tallrike biologiske hendelser finner sted i flere seksjoner. En viktig begrensning ved å anvende in vitro-modeller er mangelen på samspill mellom ulike biologiske hendelser og samspillet mellom ulike seksjoner. En viktig fordel ved å anvende insekter som mellommodeller er imidlertid at disse modellene fyller kravet til et komplekst samspill mellom ulike bestanddeler av hjerne-barrierens struktur, men også mellom de ulike seksjonene som kommer til syne hos insektene siden de er levende arter med seksjoner som i stor grad ligner virveldyr. 2 3 Blod-hjerne-barrieren (BBB) hos virveldyr utgjør den fysiologiske barrieren mellom hjernevevet og blodkarene, som begrenser utvekslingen av løst stoff og regulerer absorpsjon av eksogene midler (f.eks. legemidler) fra blodet inn i hjernen. Sentralnervesystemets (SNS) funksjon krever et finregulert ekstracellulært miljø. BBB hos virveldyr består anatomisk av mikrovaskulære endotelceller forbundet via svært spesialiserte tette celle-celleforbindelser (tight junction, TJ), som tilveiebringer en diffusjonsbarriere og således spiller en sentral rolle for permeabilitet. Nylig identifiserte TJ-bestanddeler inkluderer claudiner, en familie av fire-transmembranomspennende proteiner som er antydet å være ansvarlig for TJ-ers barrierefunksjon (Turksen og Troy 04). Penetrasjon av BBB er én av de største hindringene i utviklingen av vellykkede SNS-legemidler. På den annen side, når penetrasjon av BBB-en forekommer, kan det forårsake uønskede bivirkninger for perifert virkende legemidler (Schinkel 1999) (for gjennomgang se Pardridge 02).

4 NO/EP BBB-penetrasjon klassifiseres vanligvis som kjemisk eller biologisk basert. Den kjemisk baserte penetrasjonen er koblet til den lipidmedierte passive diffusjonen, som avhenger av molekylets fysisk-kjemiske egenskaper, dvs. små hydrofobe molekyler har tendens til å lettere penetrere BBB-en enn store hydrofile molekyler. Den biologisk baserte penetrasjonen involverer forbindelser som er substrater for BBB-ens endogene innløps- eller utløpstransportsystemer, f.eks. mange små molekyler (f.eks. legemidler) har vist seg å være substrater for P-glykoprotein (P-gp)-transportøren. P-gp-ene er transportproteiner beliggende i veggene av cellene som danner BBB-en (Schinkel 1999), og de bevares blant så varierte taksa som protozoer, planter, insekter og pattedyr (i Gaertner et al. 1998). P-gp-er er tilstedeværende i mange celletyper, og de spiller viktige roller i legemiddelabsorpsjon, -eliminasjon, -metabolisme og - toksisitet (Xia et al. 06). Det er åpenbart avgjørende i legemiddelutviklingsprosjekter å ha en forståelse av BBB-penetrasjonen, og dette bør foretrukket oppnås uten å anvende et overdrevent antall in vivo-studier. Følgelig er mange in vitro-modeller av BBBabsorpsjon utviklet for å forutsi testforbindelsers atferd in vivo. Selv komplekse in vitro-modeller som inkluderer P-gp-transportørsystemene (Di and Kerns 03, Summerfield et al. 0) synes imidlertid ikke å svare til TJ-enes intrikate kompleksitet, og beskriver kanskje ikke in vivo-atferden særlig godt. Det er sterke indikasjoner på dette i en utvidet studie av BBB-absorpsjon, der 22 forbindelser ble testet i ti ulike in vitro-modeller av BBB-absorpsjon (Garberg 0). Ingen av de ti modellene viste noen korrelasjon mellom permeabilitet in vitro og in vivo. Dette indikerer at spesifikke BBB-modeller ikke nødvendigvis tilveiebringer bedre forutsigelse enn ikke-bbb-deriverte modeller. Det ble dessuten antydet at proteinbinding, blodstrøm, metabolsk stabilitet og lipofilisitet, så vel som affinitet for andre transportører i BBB-en, er faktorer som må vurderes når det skal gjøres forutsigelser om distribusjon i hjernen in vivo Følgelig virker det som in vitro-modeller hovedsakelig er egnet for kvalitative målinger av forbindelser som penetrerer BBB ved passiv diffusjon eller forbindelser som gjennomgår utstrømning via P-gp-transportøren (Garberg 0). Enkelte virvelløse dyr har tjent som nyttige modeller for å forstå mange ulike biologiske prosesser. Spesielt er fruktfluen, Drosophila melanogaster, en vel

5 NO/EP anerkjent forskningsmodellorganisme, som har gjort betydelige bidrag til forståelsen av genetikk, nevrobiologi, molekylærbiologi osv. (Gullan og Cranston 00). Generelt har insekter og virveldyr mange fysiologiske trekk til felles. De er flercellede organismer med komplekse, inndelte nervesystemer for spesialiserte funksjoner som syn, lukt, læring og hukommelse. Insektenes nervesystemer responderer fysiologisk på lignende måter som hos virveldyr, med mange identiske nevrohormoner og -reseptorer. Insekter har avaskulære nervesystemer, der hemolymfe dekker alle ytre overflater av ganglier og nerver. Derfor krever mange insekter et avansert BBB-system for å beskytte nervesystemet sitt fra plantederiverte nevrotoksiner og for å opprettholde et passende ionisk mikromiljø for nevronene. Faktisk har et avansert BBB-system vært en evolusjonsfordel, også hos insekter. Hos insekter er denne BBB-en hovedsakelig basert på gliacellesystemet som sikkert skiftet til endotelsystemet som en respons på den økte viktigheten av mikrovaskulaturen i hjernen hos virveldyr. Tilsynekomsten av gliasystemet hos elasmobranchii-fisk og levningene av gliabarrieren i moderne pattedyrs SNS underbygger dette synspunktet. Således innehar insekter en BBB som er en viktig bestanddel i omslutningen av nervesystemet. BBB-er hos insekter er svært avanserte, men varierer i struktur mellom ulike insektordener. Således vil insekter med svært avanserte hjernebarrierer med komplekse, integrative bestanddeler som har likhet med barrierene hos virveldyr, være utmerkede modeller fro dokumentasjon av penetrasjon av ulike molekyler gjennom denne strukturen. 2 EP B1 omtaler en fremgangsmåte for å vurdere hvorvidt en kjemisk forbindelse kan transporteres gjennom blod-hjerne-barrieren til et menneske, der fremgangsmåten omfatter trinnene med å: administrere den kjemiske forbindelsen til en sebrafisk, inkubere sebrafisken, analysere sebrafisken. Khan et al. (07) omtaler en fremgangsmåte for å vurdere hvorvidt E. coli kan transporteres over blod-hjerne-barrieren hos et menneske, hvor fremgangsmåten omfatter trinnene med å: administrere E. coli til et insekt som har en blod-hjerne-barriere; inkubere insektene; dissekere insektenes hjerner; og måle konsentrasjonen av E. coli i hjernene. 3 US A1 omtaler en genmodifisert flue som uttrykker den italienske mutantversjonen av det Abeta42-peptidet av humant amyloid-betaforløperprotein (APP), og en dobbelt genmodifisert flue som uttrykker både tau-

6 NO/EP proteinet og det humane, italienske Abeta42 -peptidet av humant amyloid-betaforløperprotein (APP). De genmodifiserte fluene tilveiebringer modeller av nevrodegenerative forstyrrelser, så som Alzheimers sykdom. US A1 omtaler videre fremgangsmåter for å identifisere genetiske modifikatorer, så vel som fremgangsmåter for screening for å identifisere terapeutiske forbindelser for å behandle nevrodegenerative forstyrrelser ved hjelp av de genmodifiserte fluene. 1 WO A2 omtaler en fremgangsmåte for screening etter effekten av et testmiddel på en populasjon av insekter, omfattende trinnene med å tilveiebringe en populasjon med prøveeksemplarer, administrere minst ett testmiddel til populasjonen, lage en digital film som viser insektenes bevegelser, måle minst ett trekk ved insektene av populasjonen med effekten av testmiddelet. Dokumentet tilveiebringer også en fremgangsmåte for å fremstille et medikament som er nyttig for behandlingen av en pattedyrsykdom. Marsh og Thompson (Marsh og Thompson 06) underviser at insekter er svært nyttige som modellsystemer på grunn av kombinasjonen av enkelhet og rask reproduserbarhet. Noen av modellene (med Drosophila) har demonstrert sin effektivitet for testing av relevante legemidler og avdekket overensstemmelse mellom legemiddelvirkning hos fluer og pattedyr for sykdommer som Huntingtons, Parkinsons og Alzheimers. 2 3 Marsh og Thompson (Marsh og Thompson 04) antyder at de dominerende nevrodegenerative sykdommene hos mennesket kan modelleres eksakt hos insekter, så som Drosophila (fruktflue), siden de fremviser nøkkeltrekkene ved disse sykdommene så som sakte fremskridende degenerasjon, sen inntreden, dannelse av unormale proteinaggregater osv. Ifølge forfatterne gjør evnen til å manipulere slike konstruerte organismer det mulig å identifisere patogene mekanismer samt å teste potensielle farmakologiske regimer hurtig. Forfatterne antyder at dagens utmerkede enighet om farmakologiske behandlinger som er effektive til å hemme patologi både hos fluer og hos mus, gir økende visshet om at virvelløse modellorganismer kan produktivt fremskynde identifiseringen av midler som sannsynligvis vil være effektive ved behandling av sykdommer hos pattedyr.

7 NO/EP Slik det fremkommer av den ovennevnte litteraturen, er kjent teknikk primært rettet mod testingen av forbindelser på fluer (Drosophila) for anvendelse i behandling av humane nevrodegenerative sykdommer. Det er imidlertid fortsatt et behov for å identifisere passende screeningmodeller, utover de allment anvendte fremgangsmåtene for in vitro-testing for å bestemme/vurdere legemidlers penetrasjon av blod-hjerne-barriere. I dette henseende bør det tas i betraktning at fluer har septerte forbindelser (eng.: septate junctions, SJ) og ikke celle-celleforbindelser, som virveldyr og markgresshopper, nattsommerfugler og kakerlakker. Det er et akutt behov for mer avanserte screeningmodeller innen legemiddelutvikling, men også innen testing av SNS-toksisitet for kjemiske stoffer på markedet med mindre kjente effekter på hjernefunksjon. 1 Således er det innen legemiddelutvikling: a) et behov for effektiv screening av forbindelser med sikte på mål innenfor sentralnervesystemet. Denne screeningen utføres foretrukket i insektmodeller med intakt BBB-funksjon og vil bidra til en positiv utvelging av forbindelser som penetrerer BBB-en. Slik screening omfatter forbindelser med lav molekylvekt innenfor et antall indikasjoner (f.eks. smerte, epilepsi, Parkinson, schizofreni, Alzheimer, søvnforstyrrelser, angst, depresjon, spiseforstyrrelser, stoffmisbruk inkludert røyking). b) et behov for effektiv screening av forbindelse med sikte på virkning utenfor SNS, og som kan fremkalle uakseptable bivirkninger ved penetrasjon i SNS. 2 c) et behov for effektiv screening i insektmodeller, kjennetegnet ved selektive endringer i funksjonen av BBB. Slik screening omfatter to forbindelser eller peptider eller makromolekyler med lav til svært høy molekylvekt, i sykdommer kjennetegnet ved nedsatt BBB-funksjon (f.eks. iskemisk slag, traumatisk hjerneskade, stoffmisbruk, nevrodegenerative sykdommer som Parkinson og Alzheimer, epilepsi, infeksjoner, inflammasjon som hjernehinnebetennelse og MS, HIV). 3 Det er også et behov for screening av kjemiske forbindelser som er på markedet, som ikke er klassifisert eller dokumentert med hensyn til sin potensielle nevrotoksisitet.

8 NO/EP KORT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN 7 Det generelle formålet med den foreliggende oppfinnelsen er å utvikle screeningmodeller med insekter for å bestemme/vurdere penetrasjon av blodhjerne-barriere hos virveldyr, så som pattedyr, foretrukket mennesker, av ulike kjemiske forbindelser, for å forbedre prosedyrene/prosessene for screening av forbindelsen i den tidlige prosessen for legemiddelutvikling. Dette formålet tilbyr mange fordeler i forhold til kjent teknologi, siden insektmodeller er mer pålitelige verktøy for beslutningsprosessen enn de eksisterende in vitro-modellene, og vil gjøre legemiddelscreening-prosessen raskere og redusere attrisjonsraten i sluttfasen. Videre vil det redusere antallet pattedyr som avlives i løpet av legemiddelutviklingsfasen. 1 De foreliggende oppfinnerne har overraskende funnet at blod-hjerne-barrieren (BBB) hos insekter valgt fra gruppen bestående av kakerlakker, markgresshopper og nattsommerfugler har mer til felles med BBB hos pattedyr enn tidligere antatt. Det er funnet at barrieresystemet hos disse insektene er dannet av TJ-er, mens det hos fluene (f.eks. Drosophila) er dannet av septerte forbindelser (SJ-er) (Banerjee og Baht 07). Insektene ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan derfor tjene som en mellommodell for bestemmelse av BBBpenetrasjon av kjemiske stoffer. 2 Den foreliggende oppfinnelsen er således i stand til å for første gang tilveiebringe rasjonelle strategier for screening av forbindelser for nevrologiske indikasjoner, så vel som å generere i et enkelt in vivo-system for å bestemme en forbindelses penetrasjon i hjernen. Den foreliggende oppfinnelsen er også i stand til å tilveiebringe en rasjonell screening av forbindelser i insektmodeller som etterligner BBB-dysfunksjon som en konsekvens av nevrologiske forstyrrelser. 3 Legemiddelutvikling er en lang og kostbar prosess som krever store mengder kjemiske og biologiske ressurser. I den foreliggende oppfinnelsen er mulighetene til å anvende insekter som modellsystemer grundig utforsket, for å forbedre prosesser for utvelging av forbindelser og redusere kostnadene under legemiddelutviklingsfasen. Basert på nyere funn forventer oppfinnerne fullt ut at insektmodellene ifølge den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer et bedre grunnlag enn de eksisterende in vitro-modellene for utvelging av forbindelser som skal testes på virveldyr.

9 NO/EP I ett aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for screening av en kjemisk forbindelses BBB-penetrasjon, der fremgangsmåten består av å: administrere den kjemiske forbindelsen til insekter valgt fra ordenene bestående av Blattodea, Acridoidea, Cheleutoptera, Brachycera og Lepidoptera, inkubere insektene i et tidsrom på mellom 0,0 time og 72 timer, dissekere hjerner fra insektene, måle konsentrasjonen av den kjemiske forbindelsen i hjernene. I en foretrukket utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen er insektene valgt fra ordenene Acridoidea (markgresshopper) og Blattodea (kakerlakker). 1 I en annen foretrukket utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen inkuberes insektene i et tidsrom på mellom 0, timer og timer før insektenes hjerner dissekeres med tanke på å kvantifisere konsentrasjonen av den administrerte kjemiske forbindelsen i hjernene. 2 Dissekeringen av hjernene bør foretrukket utføres umiddelbart etter avliving av insektene. Alternativt dissekeres og fjernes hjernene fra levende insekter. Foretrukket homogeniseres og eventuelt lyseres de dissekerte hjernene for å oppnå en homogen væske som gjenspeiler hjernenes sammensetning. Væsken sentrifugeres og supernatanten lagres frem til analyse. Den videre analysen av væsken kan utføres ved hjelp av væskekromatografi, muligens med massespektrometrisk deteksjon av de eluerte forbindelsene. I ytterligere utførelsesformer tilveiebringer oppfinnelsen fremgangsmåter for screening av kjemiske forbindelser som utøver en ønsket biologisk aktivitet i kroppen, men også en uønsket biologisk aktivitet på et mål som finnes i hjernen, sentralnervesystemet og/eller øyet. 3 Således kan en fremgangsmåte for screening ifølge den foreliggende oppfinnelsen benyttes for å bestemme biologisk aktivitet for en kjemisk forbindelse og for å bestemme/vurdere den kjemiske forbindelsens evne eller manglende evne til å krysse blod-hjerne-barrieren, særlig den menneskelige blod-hjerne-barrieren, f.eks. ved å bestemme hvorvidt den kjemiske

10 NO/EP forbindelsen viser seg i noen betydelig grad eller ei, i hjernen, sentralnervesystemet eller øyet, når den ikke administreres direkte i disse vevene. I ulike aspekter og utførelsesformer tilveiebringer den foreliggende oppfinnelsen innholdet fremsatt i kravene nedenfor. 1 Oppfinnelsen kommer generelt til anvendelse for hvilke som helst legemiddelutviklingsprogrammer rettet mot en rekke sykdommer og forstyrrelser, spesifikt degenerative forstyrrelser, inkludert: Parkinsons sykdom, Alzheimers sykdom, Huntingtons sykdom, sykdommer med motornevroninklusjoner, tauopatier, kortikobasal degenerasjon; nevropsykiatriske forstyrrelser, inkludert: bipolar depresjonslidelse, schizofreni, angst og aggresjon. Videre kommer oppfinnelsen til anvendelse for legemiddelutviklingsprogrammer rettet mot perifere mål, hvor ingen SNS-drevne bivirkninger kan tolereres, eller screening av kjemiske forbindelser hvis effekter på SNS-funksjoner er ukjente. 2 Således kommer oppfinnelsen i samme grad til anvendelse for screening for kjemiske forbindelser som utøver en biologisk effekt som forandrer en aktivitet eller funksjon i sentralnervesystemet, hjernen eller øyet, enten normal eller gjenstand for en sykdom eller forstyrrelse, som for screening for kjemiske forbindelser som utøver en biologisk effekt som forbedrer et tegn eller symptom på en sykdom eller forstyrrelse. Videre tilbyr den foreliggende oppfinnelsen muligheten til å teste hvorvidt perifert virkende legemidler med kjemiske forbindelser, og toksiske kjemiske forbindelser så som pesticider, utilsiktet penetrerer BBB-en eller ei. Etter identifisering av et teststoff med ønsket biologisk aktivitet ved hjelp av en fremgangsmåte for screening i samsvar med et hvilket som helst aspekt eller en hvilken som helst utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen, kan teststoffet formuleres til en sammensetning omfattende minst én ytterligere bestanddel, for eksempel et farmasøytisk akseptabelt vehikkel, bærestoff eller hjelpestoff. 3

11 NO/EP DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN 1 Den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer ny metodologi for screening etter BBB-penetrasjon av kjemiske stoffer som kommer inn i blodbanen. Oppfinnelsen er generelt særlig nyttig for storskala-screening for midler utviklet i legemiddelutviklingsprogrammer rettet mot en rekke sykdommer og forstyrrelser, spesifikt degenerative forstyrrelser, inkludert: Parkinsons sykdom, Alzheimers sykdom, Huntingtons sykdom, sykdommer med with motornevroninklusjoner, tauopatier, kortikobasal degenerasjon; nevropsykiatriske forstyrrelser, inkludert: bipolar depresjonslidelse, schizofreni, angst og aggresjon. Videre kommer oppfinnelsen til anvendelse for legemiddelutviklingsprogrammer rettet mot perifere mål, hvor ingen SNS-drevne bivirkninger kan tolereres. Videre kommer den foreliggende oppfinnelsen til anvendelse i screeningen av midler utviklet i legemiddelutviklingsprogrammer rettet mot spiseforstyrrelser og søvnforstyrrelser osv. Den foreliggende oppfinnelsen vedrører, men er ikke begrenset til, anvendelsen av insekter valgt fra de følgende ordenene: (Taksonomi ifølge: Djurens Värld, Ed B.Hanström; Förlagshuset Norden AB, Malmø, 1964): Orden Underorden/familie Kommentar Dictyoptera Blattodea Kakkerlakk Mantodea Orthoptera Grylloidea Sisisser Acridoidea Gresshopper Cheleutoptera Lepidoptera Vandrende pinner Nattsommerfugler Hymenoptera Formicoidea Maur Vespoidea Apoidea Bombinae Dragefluer Veps Bielignende hymenoptera Humler Ekte bier Odonata Dragefluer

12 NO/EP Orden Underorden/familie Kommentar Diptera Nematocera Mygg Brachycera Fluer f.eks. Drosophila Spesielt vedrører oppfinnelsen insektsarter valgt fra Blattodea, Acridoidea, Cheleutoptera, Brachycera og Lepidoptera og mest spesielt Acridoidea-ene (Locusta migratoria og Schistocera gregaria). Oppfinnelsen vil også vedrøre de følgende ordenene omfattende insektsarter som er relevante for fremgangsmåten for screening: Orden Underorden/familie Kommentar Ephemerida Døgnfluer Plecoptera Dermoptera Forficuloidea Saksedyr Homoptera Cicadinea Sangsikader Aphidine Plantelus Heteroptera Coleoptera Trichoptera Hemiptera Biller Vårflue 1 Den foreliggende oppfinnelsen anvender foretrukket store insekter, så som vandregresshoppen, Locusta migratoria, og ørkengresshoppen, Schistocera gregaria, eller kakkerlakk der det er gjennomførbart å fôre og injisere legemidler og sammenhengende ta hemolymfeprøver og dissekere hjernevev, for analyser. Markgresshoppen er anvendt for å utvikle screeningmodeller for å bestemme BBB-penetrasjon av ulike terapeutiske legemidler og sammenligne denne modellen med eksisterende litteraturdata fra konvensjonelle in vivo-studier med virveldyr. Legemiddelutvikling er en lang og kostbar prosess som krever store mengder kjemiske og biologiske ressurser. I den foreliggende oppfinnelsen anvendes

13 NO/EP spesifikke insekter som modellsystemer for å forbedre prosesser for utvelging av forbindelser og redusere kostnadene under legemiddelutviklingsfasen. Basert på forsøk er det overraskende funnet at insektmodellene ifølge den foreliggende oppfinnelsen tilveiebringer et bedre grunnlag enn de eksisterende in vitromodellene for utvelging av forbindelser som skal testes på virveldyr. Følgelig fokuserer den foreliggende oppfinnelsen på insektmodeller som tar sikte på å gjenspeile penetrasjon av blod-hjerne-barrieren (BBB) hos virveldyr. Som angitt ovenfor er undersøkelse av BBB-penetrasjon ekstremt viktig i legemiddelutvikling; vellykkede SNS-legemidler må krysse blod-hjernebarrieren, mens BBB-penetrasjon kan forårsake uønskede bivirkninger for perifert virkende legemidler. 1 I samsvar med en foretrukket utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen anvendes vandregresshoppen Locusta migratoria og eller ørkengresshoppen Schistocera gregaria, siden den er lett å ale opp og er et relativt stort insekt (40-60 mm lang, vekt: tilnærmet 2 g, hemolymfevolum: tilnærmet 0 µl, hjernevekt: tilnærmet 2 mg). Oppfinnelsen er beskrevet i detalj i de følgende avsnittene, en kort, innledende beskrivelse av én illustrerende utførelsesform vil imidlertid hjelpe leseren i forståelsen av oppfinnelsen. Denne innledningen som beskriver en bestemt utførelsesform, er imidlertid ikke å fortolke som begrensende for oppfinnelsen. 2 Anvendelsen av en kjemisk testforbindelse på insekter ifølge den foreliggende oppfinnelsen i en fremgangsmåte for screening kan være som følger, i samsvar med en foretrukket utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen. EKSEMPLER 3 I en foretrukket utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen er insektene valgt fra ordenen Acridoidea, og spesifikt anvendes Locusta migratoria og Schistocera gregaria. Insektene kan oppnås fra lokale leverandører, eller ales opp internt og livnæres og fôres ifølge Goldsworthy et al. (03). Testforbindelser administreres oralt til hemolymfen som beskrevet av Goldworthy et al. (03) eller de administreres oralt i fôret eller ved hjelp av en

14 NO/EP sonde. For kvantitativ bestemmelse av legemiddelkonsentrasjon i hjernen, dissekeres hjernene ifølge Mokri-Moayyed et al. (08), vaskes, hurtigfryses og lagres frem til analyse. Ved analyse homogeniseres/vortekses og sentrifugeres hjernene. Legemidlet som inneholder supernatanten analyseres for sin legemiddelkonsentrasjon ved HPLC, LC-MS/MS eller andre relevante metoder. Effekten av legemiddelbehandling kan dokumenteres ved å registrere de farmakologiske effektene på atferd eller ved å anvende registreringer av nervesignalisering i sentralnervesystemet. Eksempel A 1 µl av en 9,8 mg/ml oppløsning av mianserin ble injisert i 6 gresshopper, Locusta migratoria (hanner). Etter minutter ble hjernene dissekert i fosfatbufret saltløsning (PBS) ifølge Mokri-Moayyed et al. (08). Tre hjerner ble anbrakt i hvert prøverør, og 0 µl destillert H2O og 80 µl perkloridsyre (PCA) ble tilsatt. Prøverørene ble anbrakt i en sonikator, og hjernene ble desintegrert ved sonikering i tilnærmet sekunder. Prøvene inneholdende de desintegrerte hjernene ble sentrifugert i minutter ( 000 G ved 4 C). 0 µl av supernatantene ble flyttet til nye prøverør og gjennomsnittskonsentrasjonen på 27 ng/ml mianserin ble målt ved LCMS. Eksempel B 2 µl av en 9,8 mg/ml oppløsning av mianserin ble injisert i 3 gresshopper, Locusta migratoria (hanner). Etter 1 minutter ble hjernene dissekert i fosfatbufret saltløsning (PBS) ifølge Mokri-Moayyed et al. (08). De tre hjernene ble anbrakt i et prøverør, og 0 µl destillert H2O og 80 µl perkloridsyre (PCA) ble tilsatt. Prøverøret ble anbrakt i en sonikator, og hjernene ble desintegrert ved sonikering i tilnærmet sekunder. Prøven inneholdende de desintegrerte hjernene ble sentrifugert i minutter ( 000 G ved 4 C). 0 µl av supernatanten ble flyttet til et nytt prøverør og gjennomsnittskonsentrasjonen på 73 ng/ml mianserin ble målt ved LCMS.

15 NO/EP Eksempel C µl av en 9,8 mg/ml oppløsning av mianserin ble injisert i 6 gresshopper, Locusta migratoria (hanner). Etter minutter ble hjernene dissekert i fosfatbufret saltløsning (PBS) ifølge Mokri-Moayyed et al. (08). Hjernene ble vasket én gang i PBS. Tre hjerner ble anbrakt i hvert prøverør, og 0 µl destillert H2O og 80 µl perkloridsyre (PCA) ble tilsatt. Prøverørene ble anbrakt i en sonikator, og hjernene ble desintegrert ved sonikering i tilnærmet sekunder. Prøvene inneholdende de desintegrerte hjernene ble sentrifugert i minutter ( 000 G ved 4 C). 0 µl av supernatantene ble flyttet til nye prøverør og gjennomsnittskonsentrasjonen på ng/ml mianserin ble målt ved LCMS. Eksempel D 1 µl av en 9,8 mg/ml oppløsning av mianserin ble injisert i 3 gresshopper, Locusta migratoria (hanner). Etter 1 minutter ble hjernene dissekert i fosfatbufret saltløsning (PBS) ifølge Mokri-Moayyed et al. (08). Hjernene ble vasket én gang i PBS. De tre hjernene ble anbrakt i et prøverør, og 0 µl destillert H2O og 80 µl perkloridsyre (PCA) ble tilsatt. Prøverøret ble anbrakt i en sonikator, og hjernene ble desintegrert ved sonikering i tilnærmet sekunder. Prøven inneholdende de desintegrerte hjernene ble sentrifugert i minutter ( 000 G ved 4 C). 0 µl av supernatanten ble flyttet til et nytt prøverør og en konsentrasjon på 97 ng/ml mianserin ble målt ved LCMS. 2 Eksempel E 3 µl av en 9,8 mg/ml oppløsning av mianserin ble injisert i 6 gresshopper, Locusta migratoria (hanner). Etter minutter ble hjernene dissekert i fosfatbufret saltløsning (PBS) ifølge Mokri-Moayyed et al. (08). Hjernene ble vasket to ganger i PBS. Tre hjerner ble anbrakt i hvert prøverør, og 0 µl destillert H2O og 80 µl perkloridsyre (PCA) ble tilsatt. Prøverørene ble anbrakt i en sonikator, og hjernene ble desintegrert ved sonikering i tilnærmet sekunder. Prøvene inneholdende de desintegrerte hjernene ble sentrifugert i minutter ( 000 G ved 4 C). 0 µl av supernatantene ble flyttet til nye

16 NO/EP prøverør og gjennomsnittskonsentrasjonen på 32 ng/ml mianserin ble målt ved LCMS. Studiene i eksempel A-G viser at det er en økning i konsentrasjon av mianserin i hjernen fra til 1 minutter, og dette forklares ved en lengre eksponeringstid (jf. eksempel G-I). Videre kan det konkluderes at vasking av hjernen ikke fører til noen betydelig reduksjon av konsentrasjonen i hjernen. Eksempel F 1 µl av en 9,8 mg/ml oppløsning av mianserin ble injisert i 9 gresshopper, Locusta migratoria (hanner). Etter minutter ble det gjort et snitt gjennom den frontale delen av markgresshoppens hode omfattende de mest frontale delene, inkludert antennene, fasettøynene, hjernen og alle nerveforbindelser mellom hjernen og antennene og øynene. Hjernen ble deretter dissekert i fosfatbufret saltløsning (PBS) inneholdende Evans-blått. Nervelamellen ble fjernet, og tre hjerner ble anbrakt i hvert prøverør, og 0 µl destillert H2O og 80 µl perkloridsyre (PCA) ble tilsatt. Prøverørene ble anbrakt i en sonikator, og hjernene ble desintegrert ved sonikering i tilnærmet sekunder. Prøvene inneholdende de desintegrerte hjernene ble sentrifugert i minutter ( 000 G ved 4 C). 0 µl av supernatantene ble flyttet til nye prøverør og gjennomsnittskonsentrasjonen på 9 ng/ml mianserin ble målt ved LCMS. 2 Eksempel F viser at mianserin penetrerer hjerne-blodbarrieren (BBB) hos gresshopper, og dette gjenspeiler BBB-penetrasjonen hos virveldyr. Fra eksempel A-F kan det konkluderes at noe av forbindelsen binder til nervelamellen. Således må den målte konsentrasjonen i hjernen korrigeres for dette bidraget før BBB-penetrasjonen kan konkluderes. Som et alternativ kan nervelamellen fjernet, og konsentrasjonen i hjernen er da en direkte måling for BBB-penetrasjon. Eksempel G 3 40 µl av en 8,8 mg/ml oppløsning av mianserin i -% DMSO ble injisert i 18 gresshopper, Locusta migratoria (hanner). Etter minutter ble ml hemolymfe

17 NO/EP ekstrahert fra hver markgresshoppe. Det ble gjort et snitt gjennom den frontale delen av markgresshoppens hode omfattende de mest frontale delene, inkludert antennene, fasettøynene, hjernen og alle nerveforbindelser mellom hjernen og antennene og øynene. Hjernen ble deretter dissekert i saltløsning inneholdende Evans-blått. 2 hemolymfeprøver ble anbrakt i et prøverør inneholdende 60 µl destillert H2O og 0 µl acetonitril. Hver prøve ble sentrifugert i minutter ( 000 G ved 4 C). 0 µl av supernatantene ble flyttet til nye prøverør og gjennomsnittskonsentrasjonen på 38 ng/ml mianserin ble målt ved LCMS. 1 Hver hjerne ble vasket i saltløsning og anbrakt i et prøverør inneholdende 0 µl destillert H2O. Nervelamellen ble fjernet, og 6 hjerner ble anbrakt i hvert prøverør, og 0 µl acetonitril ble tilsatt. Prøverørene ble anbrakt i en sonikator, og hjernene ble desintegrert ved sonikering i tilnærmet sekunder. Prøvene inneholdende de desintegrerte hjernene ble sentrifugert i minutter ( 000 G ved 4 C). 0 µl av supernatantene ble flyttet til nye prøverør og gjennomsnittskonsentrasjonen på 12 ng/ml mianserin ble målt ved LCMS. Eksempel H 2 40 µl av en 8,8 mg/ml oppløsning av mianserin i -% DMSO ble injisert i 18 gresshopper, Locusta migratoria (hanner). Etter 1 minutter ble ml hemolymfe ekstrahert fra hver markgresshoppe. Det ble gjort et snitt gjennom den frontale delen av markgresshoppens hode omfattende de mest frontale delene, inkludert antennene, fasettøynene, hjernen og alle nerveforbindelser mellom hjernen og antennene og øynene. Hjernen ble dissekert i saltløsning inneholdende Evans-blått. 2 hemolymfeprøver ble anbrakt i et prøverør inneholdende 60 µl destillert H2O og 0 µl acetonitril. Hver prøve ble sentrifugert i minutter ( 000 G ved 4 C). 0 µl av supernatantene ble flyttet til nye prøverør og gjennomsnittskonsentrasjonen på 17 ng/ml mianserin ble målt ved LCMS. 3 Hver hjerne ble vasket i saltløsning og anbrakt i et prøverør inneholdende 0 µl destillert H2O. Nervelamellen ble fjernet, og 6 hjerner ble anbrakt i hvert

18 NO/EP prøverør, og 0 µl acetonitril ble tilsatt. Prøverørene ble anbrakt i en sonikator, og hjernene ble desintegrert ved sonikering i tilnærmet sekunder. Prøvene inneholdende de desintegrerte hjernene ble sentrifugert i minutter ( 000 G ved 4 C). 0 µl av supernatantene ble flyttet til nye prøverør og gjennomsnittskonsentrasjonen på ng/ml mianserin ble målt ved LCMS. Eksempel I 1 40 µl av en 8,8 mg/ml oppløsning av mianserin i -% DMSO ble injisert i 18 gresshopper, Locusta migratoria (hanner). Etter 4 minutter ble ml hemolymfe ekstrahert fra hver markgresshoppe. Det ble gjort et snitt gjennom den frontale delen av markgresshoppens hode omfattende de mest frontale delene, inkludert antennene, fasettøynene, hjernen og alle nerveforbindelser mellom hjernen og antennene og øynene. Hjernen ble dissekert i saltløsning inneholdende Evans-blått. 2 hemolymfeprøver ble anbrakt i et prøverør inneholdende 60 µl destillert H2O og 0 µl acetonitril. Hver prøve ble sentrifugert i minutter ( 000 G ved 4 C). 0 µl av supernatantene ble flyttet til nye prøverør og gjennomsnittskonsentrasjonen på 13 ng/ml mianserin ble målt ved LCMS. 2 Hver hjerne ble vasket i saltløsning og anbrakt i et prøverør inneholdende 0 µl destillert H2O. Nervelamellen ble fjernet, og 6 hjerner ble anbrakt i hvert prøverør, og 0 µl acetonitril ble tilsatt. Prøverørene ble anbrakt i en sonikator, og hjernene ble desintegrert ved sonikering i tilnærmet sekunder. Prøvene inneholdende de desintegrerte hjernene ble sentrifugert i minutter ( 000 G ved 4 C). 0 µl av supernatantene ble flyttet til nye prøverør og gjennomsnittskonsentrasjonen på 393 ng/ml mianserin ble målt ved LCMS. 3 Fra eksempel G-I kan det konkluderes at konsentrasjonen av mianserin i hemolymfen reduseres med tiden, mens konsentrasjonen i hjernen øker fra -1 minutter og flater ut fra 1-4 minutter. Dette gjenspeiler situasjonen hos virveldyr, hvor en lengre hjerneeksponering øker nivået i hjernen til en viss grense. Videre er forbindelsens clearance i hjernen hos virveldyr saktere enn i kroppsvæsken, dvs. nøyaktig slik det ses i eksempel G-I.

19 NO/EP Eksempel J µl av en 6 mg/ml oppløsning av serotonin ble injisert i 6 gresshopper, Locusta migratoria (hanner). Etter minutter ble ml hemolymfe ekstrahert fra hver markgresshoppe. Det ble gjort et snitt gjennom den frontale delen av markgresshoppens hode omfattende de mest frontale delene, inkludert antennene, fasettøynene, hjernen og alle nerveforbindelser mellom hjernen og antennene og øynene, og hjernen ble dissekert i saltløsning. Hver hemolymfeprøve ble anbrakt i et prøverør inneholdende 80 µl destillert H2O og 0 µl acetonitril. Hver prøve ble sentrifugert i minutter ( 000 G ved 4 C). 0 µl av supernatantene ble flyttet til nye prøverør og gjennomsnittskonsentrasjonen på 4,7 ug/ml serotonin ble målt ved LCMS. 1 Hver hjerne ble vasket i saltløsning og anbrakt i et prøverør inneholdende 0 µl destillert H2O. Tre hjerner ble anbrakt i hvert prøverør, og 0 µl acetonitril ble tilsatt. Prøverørene ble anbrakt i en sonikator, og hjernene ble desintegrert ved sonikering i tilnærmet sekunder. Prøvene inneholdende de desintegrerte hjernene ble sentrifugert i minutter ( 000 G ved 4 C). 0 µl av supernatantene ble flyttet til nye prøverør og gjennomsnittskonsentrasjonen på 86, ng/ml serotonin ble målt ved LCMS. Eksempel K hjerner fra gresshopper, Locusta migratoria (hanner), ble anvendt for å måle det endogene serotoninnivået i hjernen. Det ble gjort et snitt gjennom den frontale delen av markgresshoppens hode omfattende de mest frontale delene, inkludert antennene, fasettøynene, hjernen og alle nerveforbindelser mellom hjernen og antennene og øynene, og hjernen ble dissekert i saltløsning. Hver hjerne ble vasket i saltløsning og anbrakt i et prøverør inneholdende 0 µl destillert H2O. Tre hjerner ble anbrakt i ett prøverør, og 0 µl acetonitril ble tilsatt. Prøverøret ble anbrakt i en sonikator, og hjernene ble desintegrert ved sonikering i tilnærmet sekunder. Prøven inneholdende de desintegrerte hjernene ble sentrifugert i minutter ( 000 G ved 4 C). 0 µl av supernatanten ble flyttet til et nytt prøverør og en konsentrasjon på ng/ml serotonin ble målt ved LCMS.

20 NO/EP Eksempel A-F viste at den målte konsentrasjonen av mianserin økes med en faktor på 3 når nervelamellen inkluderes i målingen av konsentrasjon i hjernen. Det er rimelig å anta at serotoninen som er bundet til nervelamellen svarer for et lignende bidrag som i mianserinstudiene. Således antyder introduksjonen av en korreksjonsfaktor basert på mianserinforsøkene at den faktiske, målte serotoninkonsentrasjonen i hjernen i eksempel J er nær det endogene serotoninnivået målt i eksempel K. Fra eksempel J og K kan det konkluderes at serotonin, hvis overhodet, kun penetrerer gresshoppers BBB i svært liten grad. En svært lav BBB-penetrasjon av serotonin ses også hos virveldyr. Eksempel L 1 2 µl av en 8,4 mg/ml -% DMSO-oppløsning av buspiron ble injisert i 6 gresshopper, Locusta migratoria (hanner). Etter minutter ble ml hemolymfe ekstrahert fra hver markgresshoppe. Det ble gjort et snitt gjennom den frontale delen av markgresshoppens hode omfattende de mest frontale delene, inkludert antennene, fasettøynene, hjernen og alle nerveforbindelser mellom hjernen og antennene og øynene, og hjernen ble dissekert i saltløsning. Hver hemolymfeprøve ble anbrakt i et prøverør inneholdende 80 µl destillert H2O og 0 µl acetonitril. Hver prøve ble sentrifugert i minutter ( 000 G ved 4 C). 0 µl av supernatantene ble flyttet til nye prøverør og gjennomsnittskonsentrasjonen på 4, ug/ml buspiron ble målt ved LCMS. Hver hjerne ble vasket i saltløsning og anbrakt i et prøverør inneholdende 0 µl destillert H2O. Tre hjerner ble anbrakt i hvert prøverør, og 0 µl acetonitril ble tilsatt. Prøverørene ble anbrakt i en sonikator, og hjernene ble desintegrert ved sonikering i tilnærmet sekunder. Prøvene inneholdende de desintegrerte hjernene ble sentrifugert i minutter ( 000 G ved 4 C). 0 µl av supernatantene ble flyttet til nye prøverør og en gjennomsnittskonsentrasjon under ng/ml buspiron ble målt ved LCMS. 3 Det var åpenbart fra dette eksemplet at buspiron penetrerer gresshoppens BBB, men det er i en mye lavere fraksjon enn i tilfellet med mianserin. Dette resultatet gjenspeiler BBB-penetrasjon hos virveldyr, hvor det er men mye

21 NO/EP lavere BBB-penetrasjon av buspiron enn den tilsvarende penetrasjonen av mianserin. LITTERATUR Banerjee and Baht (07), Neuron-Glial Interactions in Blood-Brain Barrier Formation Annual Review of Neuroscience : Di, L. and Kerns, E.H. (03). Profiling drug-like properties in discovery research. Current Opinion in Chemical Biology 7, Gaertner, L.S., Murray, C.L., Morris, C.E. (1998). Transepithelial transport of nicotine and vinblastine in isolated malpighian tubules of the tobacco hornworm (Manduca sexta) suggests a P-glycoprotein-like mechanism. The Journal of Experimental Biology 1, Garberg, P. et al. (0). In vitro models for the blood-brain barrier. Toxicology in Vitro 19, Goldsworthy, G et al. (03) Adipokinetic hormone enhances nodule formation and phenoloxidase activation in adult locusts injected with bacterial lipopolysaccaride. J. Insect. Physiol., 49, Gullan, P.J and Cranston, P.S. (00). The insects. An outline of entomology. Blackwell Science Ltd. Marsh, J.L., and Thompson, L.M. (04). Can flies help humans treat neurodegenerative diseases? Bioessays 26, Marsh, J.L. and Thompson, L.M. (06). Drosophila in the Study of Neurodegenerative Disease. Neuron 2, Mokri-Moayyed, B et al., (08). Development of a novel ex vivo insect model for studying virulence determinants of Escherichia coli K1. J. Medical Microbiol. 7, 6-1. Pardridge, W.M. (02). Drug and gene targeting to the brain with molecular Trojan horses. Nature Reviews Drug Discovery 1, Ruiz-Garcia, A., Bermejo, M., Moss A., Casabo, V.G. (07). Pharmacokinetics in drug discovery. Journal of Pharmaceutical Sciences, Schinkel, A.H. (1999). P-Glycoprotein, a gatekeeper in the blood-brain barrier. Advanced Drug Delivery Reviews 36,

22 NO/EP Summerfield, S. et al. (0). Improving the In Vitro Prediction of In Vivo CNS Penetration: Integrating Permeability, Pgp Efflux and Free Fractions in Blood and Brain. Journal of Pharmacology And Experimental Therapeutics. Turksen, K. and Troy, T.-C. (04). Barriers built on claudins. Journal of Cell Science 117, Xia, C.Q., Xiao, G., Liu, N., Pimprale, S., Fox, L., Patten, C.J., Crespi, C.L., Miwa, G., Gan, L.-S. (06). Comparison of Species Differences of P-Glycoproteins in Beagle Dog, Rhesus Monkey, and Human Using ATPase Activity Assays. Molecular Pharmaceutics 3 (1),

23 NO/EP Patentkrav 1. Fremgangsmåte for å vurdere hvorvidt en kjemisk forbindelse kan transporteres gjennom blod-hjerne-barrieren (BBB) til et virveldyr, foretrukket et pattedyr, så som et menneske, der fremgangsmåten omfatter trinnene med å: administrere den kjemiske forbindelsen til et insekt som har en BBB, inkubere insektene, dissekere hjerner fra insektene, og måle konsentrasjonen av den kjemiske forbindelsen i hjernene. 2. Fremgangsmåten ifølge krav 1, hvori insektene er valgt fa gruppen bestående av ordenene Blattoidea, Diptera, Acridoidea, Cheleutoptera, Brachycera og Lepidoptera Fremgangsmåten ifølge krav 1, hvori insektene inkuberes i et tidsrom på mellom 0, timer og timer før insektenes hjerner dissekeres med tanke på å kvantifisere konsentrasjonen av den administrerte kjemiske forbindelsen i hjernene. 4. Fremgangsmåten ifølge krav 1, hvori disseksjonen av hjernene utføres umiddelbart etter avliving av insektene. 2. Fremgangsmåten ifølge krav 1, hvori måling av konsentrasjonen av den kjemiske forbindelsen utføres ved å homogenisere de dissekerte hjernene, foretrukket sentrifugere homogenatet og analysere konsentrasjonen av den kjemiske forbindelsen i homogenatet ved væskekromatografi, eventuelt ved massespektrometrisk deteksjon av de eluerte forbindelsene. 6. Fremgangsmåten ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, hvori den kjemiske forbindelsen administreres parenteralt eller peroralt Fremgangsmåten ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, omfattende bestemmelse av den kjemiske forbindelsens konsentrasjonsgradienter fra kropp:hjerne for å kvantitativt bestemme BBBpenetrasjon.

24 NO/EP Fremgangsmåten ifølge et hvilket som helst av de foregående krav, omfattende sammenligning av relativ effekt av kjemiske forbindelser med ønsket aktivitet i sentralnervesystemet i nærvær av en blod-hjerne-barriere. 9. Fremgangsmåten ifølge krav 7, omfattende bestemmelse av hvorvidt en kjemisk forbindelse metaboliseres av blod-hjerne-barrieren.. Anvendelse av insekter valgt fra gruppen bestående av ordenene Blattodea, Diptera, Acridoidea, Cheleutoptera, Brachycera og Lepidoptera for å vurdere hvorvidt en kjemisk forbindelse transporteres gjennom blod-hjerne-barrieren til et virveldyr, foretrukket et pattedyr, så som et menneske.