(12) Oversettelse av europeisk patentskrift

Transkript

1 (12) Oversettelse av europeisk patentskrift (11) NO/EP B1 (19) NO NORGE (1) Int Cl. A23K 1/00 (06.01) A23K 1/18 (06.01) A61K 3/74 (06.01) Patentstyret (21) Oversettelse publisert (80) Dato for Den Europeiske Patentmyndighets publisering av det meddelte patentet (86) Europeisk søknadsnr (86) Europeisk innleveringsdag.0. (87) Den europeiske søknadens Publiseringsdato () Prioritet , GB, , GB, (84) Utpekte stater AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO SE SI SK SM TR (73) Innehaver Bioprotein AS, Professor Olav Hanssens vei, 4021 StavangerNorge (72) Oppfinner ROMARHEIM, Odd Helge, Langbakken 1, N-14 snorge ØVERLAND, Margareth, Danskerudbråten, N-14 snorge MYDLAND, Liv Torunn, Moerveien 36b, N-14 snorge SKREDE, Anders, Ameborgveien, N-14 snorge LANDSVERK, Thor, Hollavegen 164, N-3677 NotoddenNorge (74) Fullmektig Bryn Aarflot AS, Postboks 449 Sentrum, 04 OSLO, Norge (4) Benevnelse Fôrsammensetning for behandling eller forebygging av enteritt i fisk (6) Anførte publikasjoner WO-A1-03/034 WO-A1-0/ WO-A2-03/ European Commission: "Report of the Scientific Committee on animal nutrition on the use in animal feed of protein-rich biomass derived largely from cells of methanotrophic bacteria grown using natural gas as a carbon source" 22 October 1999 ( ), XP Retrieved from the Internet: URL: t3_en.pdf [retrieved on -08-0] AAS ET AL: "Effects of diets containing a bacterial protein meal on growth and feed utilisation in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss)" AQUACULTURE, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL LNKD- DOI:.16/J.AQUACULTURE , vol. 261, no. 1, 6 November 06 ( ), pages , XP ISSN: AAS TURID SYNNOVE ET AL: "Feed intake, growth and nutrient utilization in Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus) fed diets containing a bacterial protein meal" March 07 (07-03), AQUACULTURE RESEARCH, VOL. 38, NR. 4, PAGE(S) , XP ISSN: 13-7X *Diet Composition*; page 32

2 1 Fôrsammensetning for behandling eller forebygging av enteritt i fisk Beskrivelse 2 3 Foreliggende oppfinnelse angår anvendelse av et encelleprotein-materiale oppnådd fra en kultur av metanotrofe bakterier for behandling og/eller forebygging av enteritt hos fisk, spesielt for forebygging eller forbedring av soya-indusert enteritt hos karnivore fisk, f.eks. salmonider slik som Atlanterhavslaks. Fôrkomponenter står for ca. en tredjedel av de totale kostnadene ved oppdrett av fisk slik som laks og ørret. Fiskemel har tradisjonelt vært den viktigste proteinkilden i fôr for karnivore fisk. Prisen på fiskemel er imidlertid stadig stigende og den predikerte økningen i akvakulturproduksjon antyder at verdens tilgang på fiskemel ikke vil være tilstrekkelig til å dekke fremtidig etterspørsel. Alternative kilder for næringsstoffer er derfor nødvendig for å erstatte i det minste en del av fiskemelfraksjonen av fôr innen akvakultur. Innen akvakulturindustrien har oppmerksomheten i det siste blitt rettet mot plantebaserte ingredienser, spesielt planteproteinkilder, på grunn av deres lette tilgjengelighet og lave kostnad. Slike materialer byr imidlertid på flere problemer som begrenser utstrakt anvendelse derav i akvakultur. Den mest bredt tilgjengelige planteproteinråvaren, soyamel ("soybean meal"), blir markedsført som et fôrstoff med høy næringsverdi for oppdrettede dyr, inkludert laks og ørret, og er tilgjengelig i former som fullfett soyamel (dvs. ikke redusert oljeinnhold) og avfettet soyamel (redusert oljeinnhold). Hos Atlantisk laks og regnbueørret forårsaker imidlertid soyamel, selv i lave nivåer i dietten, enteritt (en skadelig inflammatorisk reaksjon i distal del av tarmen) som er en stor etisk utfordring og i sin tur fører til svekket vekst og fôrutnyttelse (Baeverfiord og Krogdahl, Journal of Fish Diseases (1996), 19: ). Denne lidelsen blir ofte referert til som "soya-indusert enteritt" og er hovedårsaken til lav eller ingen inklusjon av soyamel i dietter for laks og ørret. Lidelsen kan også induseres av andre plantematerialer, slik som erteproteinkonsentrat (Penn et al., XIII International Symposium on Fish Nutrition and Feeding, Florianὸpolis, Brasil (08), Book of Abstracts, s. 86). Selv om de spesifikke effektene av alternative proteinkilder på fordøyelsesfysiologien hos fisk har blitt mest inngående studert med hensyn til soyaprodukter i fôr for oppdrettedee salmonider, antyder en nyere rapport fra Vitenskapskomiteen for mattrygghet at det kunne være lignende responser på andre planteproteinkilder anvendt av fiskefôrindustrien. Det er følgelig forventet at andre plantematerialer, slik som erteproteinkonsentrat, enten alene eller i kombinasjon, vil oppvise de samme skadelige

3 2 2 3 effektene som soyamel når de gis til fisk som en erstatning for fiskemel eller andre ingredienser som ikke forårsaker enteritt. Alvorlighetsgraden av de morfologiske endringene observert ved fôring med plante-avledete produkter, slik som soyamel, til fisk avhenger av inklusjonsnivået derav i dietten. For eksempel kan enteritt i distal del av tarmen påvises hos laks fôret med en diett inneholdende så lite som vekt-% soyamel, hvor dietter som omfatter % eller mer soyamel (verdier basert på totalt protein i dietten) fører til alvorlige morfologiske endringer (Krogdahl et al, Aquaculture Nutrition (03), 9: ). Avfettet soyamel induserer alvorlige morfologiske endringer i distal del av tarmen hos Atlantisk laks og regnbueørret. Lignende endringer er observert ved fôring med soyamel til annen fisk, slik som gyllenhodet havkaruss, "sea bream", karpe, asiatisk havabbor og kanalmalle (Ictalurus punctatus), selv om disse er noe mindre alvorlige. Lidelsen "soya-indusert enteritt" forårsakes ikke av proteinene i fôret, men heller av én eller flere alkohol-oppløselige komponenter i ikke-protein-fraksjonen. Proteinkonsentrater og isolater produsert fra plantebaserte materialer (f.eks. soyabønne) etter alkoholekstraksjon kan derfor anvendes uten å forårsake enteritt. Slike produkter er imidlertid svært kostbare. Selv om alternative planteproteinkilder som for eksempel soyamel representerer lovende kandidater for delvis erstatning av fiskemel i fôr innen akvakultur, kan de følgelig for øyeblikket ikke anvendes i noen betydelig mengde i fiskefôr på grunn av problemet med enteritt. Foreliggende oppfinnelse forsøker å ta tak i dette problemet. Foreliggende oppfinnere har nå overraskende funnet at tilsetning av et bakterielt proteinmel eller "biomasse" avledet fra en kultur omfattende metanotrofe bakterier (også referert til heri ganske enkelt som et "bakterielt proteinmel") til dietten til fisk kan forebygge eller forbedre plante-indusert enteritt. Spesielt er det funnet at tilsetning av lave til moderate nivåer av bakterielt proteinmel til dietter for fisk som omfatter plantebaserte materialer i nivåer som ellers ville forårsake enteritt gjør slike materialer sikre som fôr til fisk. Sammensetninger av bakterielt protein, f.eks. slike som omfatter encelleproteiner av metanotrofe bakterier, er kjent for anvendelse som fôrstoff til dyr. For eksempel beskriver WO 03/034 anvendelse av et encelleprotein avledet fra Methylococcus capsulatus som et fôr for fisk og skalldyr. Imidlertid har det ikke tidligere blitt foreslått at et bakterielt proteinmel av metanotrofe bakterier kan anvendes for å forebygge eller forbedre plante-indusert enteritt hos fisk, f.eks. soya-indusert enteritt. Følgelig tilveiebringer oppfinnelsen i et første aspekt en biomasse avledet fra en kultur av metanotrofe bakterier for forebygging eller forbedring av plante-indusert enteritt hos fisk.

4 3 2 3 Typisk vil biomassen bli direkte innblandet i et konvensjonelt fiskefôr, for eksempel et formulert fiskefôr, som også vil omfatte det plantebaserte materialet ansvarlig for å forårsake enteritt. I et ytterligere aspekt tilveiebringer oppfinnelsen følgelig et fiskefôr omfattende en biomasse avledet fra en kultur av metanotrofe bakterier i kombinasjon med et plantemateriale som forårsaker enteritt. Som anvendt heri vil betegnelsen "fiskefôr" generelt forstås å være et komplett fôr for fisk, dvs. ett som omfatter alle de nødvendige komponentene i en diett for fisk. I et relatert aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en fiskefôrkomponent omfattende (f.eks. bestående hovedsakelig av) en biomasse avledet fra en kultur av metanotrofe bakterier i kombinasjon med et plantemateriale som forårsaker enteritt. Denne fôrkomponenten kan tilveiebringes, for eksempel, som en blanding av nevnte biomasse og nevnte plantemateriale for anvendelse som en ingrediens (f.eks. en proteininneholdende ingrediens) ved fremstilling av et fiskefôr. I et relatert aspekt tilveiebringer oppfinnelsen videre et fiskefôr eller fiskefôrkomponent omfattende en biomasse avledet fra en kultur av metanotrofe bakterier for forebygging eller forbedring av plante-indusert enteritt hos fisk. I et ytterligere aspekt tilveiebringer oppfinnelsen anvendelse av en biomasse som heri beskrevet ved fremstilling av et middel (f.eks. ved fremstilling av et fiskefôr eller fiskefôr-komponent) for forebygging eller forbedring av plante-indusert enteritt hos fisk. I enda et ytterligere aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å forebygge eller forbedre plante-indusert enteritt hos fisk, hvor nevnte fremgangsmåte omfatter å administere til nevnte fisk en biomasse, et fiskefôr eller en fiskefôrkomponent som heri beskrevet. Med betegnelsen "plante-indusert enteritt" menes en subakutt inflammatorisk tilstand i mukosa i distal del av tarmen som kommer av inntak av et plantemateriale. Nærmere bestemt skal betegnelsen referere til en lidelse assosiert med én eller flere av de følgende endringene i distal del av tarmen: (1) utvidelse og forkortelse av tarmens folder; (2) tap av normal supranukleær dannelse av vakuoler i de absorptive cellene (enterocyttene) i intestinal mukosa; (3) utvidelse av sentral lamina propria i tarmens folder, med økt mengde av bindevev; og (4) infiltrasjon av en blandet leukocyttpopulasjon (inflammatoriske celler) i lamina propria og submukosa. Disse morfologiske endringene er forbundet med svekket funksjonalitet av distal del av tarmen og er karakteristisk for endringene indusert hos fisk (spesielt hos laks og ørret) ved soyamel i dietten. Slike endringer kan lett identifiseres av fagfolk fra en histologisk studie av snitt av distal del av tarmen. Figur 1B er et eksempel på de morfologiske karakteristika av distal del av tarmen hos laks når den blir fôret med en diett som omfatter soyamel.

5 4 2 3 Plantematerialer som kan forårsake enteritt omfatter hele, bearbeidede eller ekstraherte planteprodukter, spesielt planteproteinmaterialer. Slike materialer kan, for eksempel være avledet fra hvilke som helst av følgende kilder: soyabønne, solsikke, lupin, rapsfrø, canola, bomullsfrø, peanøtter, erter (f.eks. gråerter), bønner (f.eks. fababønne), korn, bygg, hvete og mais. Plantematerialer egnet for anvendelse i oppfinnelsen er slike som gir næringsverdi i fiskefôr og som er egnet for anvendelse som en ingrediens i fiskefôr, f.eks. egnet for delvis erstatning av konvensjonelle fôringredienser slik som fiskemel. Slike produkter er slike som forårsaker enteritt hos fisk. Spesifikke eksempler på materialer som kan forårsake enteritt eller enteritt-lignende lidelser hos fisk (avhengig av inklusjonsnivåer derav i dietten) omfatter soyabønne (fullfett, avfettet, avskallet eller ikke avskallet), solsikke (f.eks. avfettet solsikke), lupin (f.eks. avskallet lupin), rapsfrø (f.eks. avfettet "double low" rapsfrø), hel gråert, erteproteinkonsentrat, fababønner (f.eks. hele og avskallede fababønner), ko-produkter avledet fra biobrenselproduksjon og bryggeriindustrien, byggproteinkonsentrat, hvetegluten og maisgluten. Disse ingrediensene kan tilveiebringes uten varmebehandling, eller kan forbehandles ved metoder slik som steking, toasting, behandling med mikrobølger, ekspandering, pelletering, ekstrudering eller andre kjente varmebehandlinger. Soyaprodukter er ett eksempel på et plantebasert materiale kjent å forårsake enteritt hos fisk. Slike produkter er bredt tilgjengelig i flere ulike former og alle disse anses som egnet for anvendelse i oppfinnelsen. Disse omfatter løsningsmiddelekstrahert soyamel som refererer til soyabønne-produktet etter ekstraksjon av en del av oljen ved løsningsmidler som heksan; soyabønnekake avledet ved mekanisk trykk eller soyabønnechips; soyamel som er malte løsningsmiddelekstraherte soyabønneflak eller malt soyabønnekake, malt soyabønnechips eller malt soyabønneflak; soyabønne kvernfôr som er biproduktet som er et resultat av fremstilling av soyabønne-mel eller korn og består av soyabønnebelger og avfallet fra enden av mølla (en typisk analyse med hensyn til vekt er 13 % råprotein, 32 % råfiber og 13 % fuktighet); soyabønne kvern "run" som er produktet som er et resultat av fremstilling av avskallet soyabønnemel og består av soyabønnebelger og bønne-kjøtt som sitter fast i belgen under normale malingsoperasjoner (en typisk analyse med hensyn til vekt er 11 % råprotein, 3 % råfiber og 13 % fuktighet); soyabønnebelger som er et produkt bestående primært av det ytre dekket fra søyabønne; og løsningsmiddelekstraherte soyaflak som er produktet oppnådd etter ekstraksjon av en del av oljen fra soyabønner ved anvendelse av heksan eller homologe hydrokarbon-løsningsmidler. Soyamel er kommersielt tilgjengelig i fullfett (dvs. ikke redusert oljeinnhold) og avfettet (redusert oljeinnhold) form. Soyamel blir typisk avfettet ved løsningsmiddelekstraksjon av oljer ved anvendelse av heksan eller homologe

6 hydrokarbon-løsningsmidler (f.eks. n-heksan eller 2,3 dimetylpentan) som deretter blir destillert bort i løpet av toastingsprosessen. Avfettet soyamel (også kjent som "ekstrahert" soyamel) har typisk følgende sammensetning (% gitt med hensyn til vekt): Protein (N x 6,2) min. 42 % Fett min. 0,2 % Råfiber maks 8,0 % Aske maks 7,0 % Vann maks 12 % eller maks 13, % 2 3 Totale karbohydrater representerer det resterende, dvs. omtrent % (av hvilket omtrent % er oligosakkarider, resten er hovedsakelig ikke-stivelse polysakkarider (f.eks. galaktaner, arabinan)). Analyse av soyaprodukter kan utføres i henhold til standard testmetoder som godkjent av "The American Oil Chemists Society (AOCS), f.eks. AOCS Method Ba 2a-38 (fuktighet), AOCS Method Ba 4e-93 (protein), AOCS Method Ba 6-84 (råfiber) og AOCS Method Ba 3-38 (olje). Soyamel kan være avskallet (dvs. ha et lavere fiberinnhold og høyere råproteininnhold), eller ikke avskallet. Som anvendt heri referer betegnelsen "soyamel" generelt til hvilket som helst materiale avledet fra soyabønne og som er egnet for anvendelse som en fiskefôringrediens (med eller uten ytterligere prosessering). Egnet soyamel for anvendelse i henhold til oppfinnelsen kan oppnås fra Denofa AS, Norge. Foretrukket omfatter soyamelet en enteritt-fremkallende alkoholløselig fraksjon, dvs. soyamelet er i stand til å forårsake enteritt hos mottakelig fisk. Nyere studier har antydet at plantesaponiner kan være en av de ansvarlige faktorene som forårsaker symptomer på enteritt hos fisk. Saponiner er naturlig forekommende amfifile molekyler bestående av en sukkergruppe bundet til et steroid eller triterpen aglykon. De er vidt utbredt i ville planter og er også til stede i mange dyrkede avlinger inkludert soyabønner og lupinfrø. Typiske nivåer av saponin i avfettet soyamel er -7 g/kg. Plantematerialet eller plantekilden for anvendelse i oppfinnelsen er følgelig foretrukket et/en som naturlig omfatter en andel av saponiner. Foretrukket er plantematerialet et materiale som inneholder planteprotein, f.eks. fullfett soyamel, avfettet soyamel eller erteproteinkonsentrat (f.eks. erteproteinkonsentrat med et proteininnhold på minst %). Mest foretrukket er materialet soyamel. I en foretrukket utførelsesform omfatter plantematerialet planteproteiner og saponiner. I en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen blir enteritt indusert av ett av plantematerialene beskrevet heri. I en spesielt foretrukket utførelsesform er den planteinduserte enteritt soya-indusert enteritt.

7 6 2 3 Biomassen for anvendelse i henhold til oppfinnelsen er avledet fra eller omfatter en kultur av metanotrofe bakterier, foretrukket en kultur inneholdende Methylococcus capsulatus, spesielt Methylococcus capsulatus (Bath). I en foretrukket utførelsesform er biomassen avledet fra eller omfatter en stor andel av metanotrofe bakterier og en mindre andel av heterotrofe bakterier, foretrukket Methylococcus capsulatus i tillegg til Ralstonia sp., Brevibacillus agri og Aneurinibacillus sp. Foretrukne bakterier for anvendelse i biomasse-materialet omfatter Methylococcus capsulatus (Bath), en termofil bakterie opprinnelig isolert fra de varme kildene i Bath, England og deponert som NCIMB 426 (tidligere NCIMB 11132) ved The National Collections of Industrial and Marine Bacteria, Aberdeen, Skotland. Andre bakterier egnet for anvendelse i oppfinnelsen omfatter den heterotrofe bakterien DB3, stamme NCIMB 427 (Ralstonia sp. tidligere kjent som Alcaligenes acidovorans DB3; tidligere NCIMB 13287), DB, stamme NCIMB 42 (Brevibacillus agri tidligere kjent som Bacillus firmus DB; tidligere NCIMB 13289) og DB4, stamme NCIMB 428 (Aneurinibacillus sp. tidligere kjent som Bacillus brevis DB4; tidligere NCIMB 13288) som hver især har optimal vekst ved en temperatur på omtrent 4 C. Detaljer angående egenskapene av disse bakteriestammene er gitt i WO 03/072133, idet innholdet i denne er omfattet heri i sin helhet. En spesielt foretrukket biomasse for anvendelse i henhold til oppfinnelsen er den fremstilt fra en mikrobiell kultur av de ovennevnte stammene og er tilgjengelig fra Norferm AS, Norge under varenavnet BioProtein. Biomassen for anvendelse i oppfinnelsen er avledet fra en mikrobiell kultur som omfatter en metanotrof bakteriestamme, eventuelt i kombinasjon med én eller flere arter av heterotrofe bakterier, spesielt foretrukket en kombinasjon av metanotrofe og heterotrofe bakteriestammer. Som anvendt heri omfatter "metanotrof" hvilken som helst bakterie som utnytter metan, metanol eller formaldehyd for vekst. Betegnelsen "heterotrof" anvendes for bakterier som utnytter organiske substrater andre enn metan, metanol eller formaldehyd for vekst. Den bakterielle biomassen for anvendelse i fremgangsmåtene heri beskrevet kan dannes ved dyrking av bakteriene i et egnet medium eller substrat. Den nøyaktige karakteren av dyrkingsmediet anvendt for fremstilling av biomassen er ikke kritisk og mange forskjellige egnede substrater kan anvendes. Hensiktsmessig kan biomassen fremstilles ved en fermenteringsprosess i hvilken oksygen og et passende substrat slik som et flytende eller gassformet hydrokarbon, en alkohol eller karbohydrat, f.eks. metan, metanol eller naturgass, sammen med en nitrogenkilde (foretrukket ammoniakk) og en næringsrik mineralløsning tilføres til en rørformet reaktor inneholdende mikroorganismene. Flere slike prosesser er velkjent og beskrevet på området, for eksempel i WO 01/60974, DK-B , EP-A og EP-A-6466, idet innholdet i disse er omfattet heri ved referanse.

8 7 2 3 Biomassematerialet for anvendelse i oppfinnelsen vil foretrukket være avledet fra fermentering på hydrokarbonfraksjoner eller på naturgass. Spesielt foretrukket er biomassematerialer avledet fra fermentering av naturgass. Generelt i slike prosesser, ettersom konsentrasjonen av mikroorganismer øker i fermentoren, blir en del av reaktorinnholdet eller mediet tatt ut og mikroorganismene kan separeres ved teknikker velkjent på området, f.eks. sentrifugering og/eller ultrafiltrering. Hensiktsemssig vil, i en slik fermenteringsprosess, mediet bli kontinuerlig tatt ut fra fermentoren og vil ha en cellekonsentrasjon på mellom 1 og vekt-%, f.eks. omtrent 3 vekt-%. Spesielt foretrukket for anvendelse i oppfinnelsen er en mikrobiell kultur omfattende en kombinasjon av den metanotrofe bakterien Methylococcus capsulatus (Bath) (stamme NCIMB 426), og de heterotrofe bakteriene DB3 (stamme NCIMB 427) og DB (stamme NCIMB 42), eventuelt i kombinasjon med DB4 (stamme NCIMB 428). Rollen til DB3 er å utnytte acetat og propionat produsert av M. capsulatus (Bath) fra etan og propan i naturgassen. DB3 kan stå for opptil %, f.eks. omtrent 6 til 8 %, av det totale celletallet i den resulterende biomassen. Rollen til DB4 og DB er å utnytte lysisprodukter og metabolitter i mediet. DB4 og DB vil typisk stå for mindre enn 1 % av celletallet under kontinuerlig fermentering. Egnede fermentorer for anvendelse ved fremstilling av biomassen er slike som er av loop-type, slik som de beskrevet i DK 1404/92, EP-A og EP A 6466 ved Dansk Bioprotein, eller "airlift"-reaktorer. Andre fermentorer kan anvendes for fremstilling av biomassen og disse omfatter rørformet og omrørt tank fermentorer. Typisk kan biomassen fremstilt fra fermentering av naturgass omfatte fra 60 til 80 % med hensyn til tørrvekt råprotein; fra til vekt-% råfett; fra 3 til vekt-% aske; fra 3 til vekt-% nukleinsyrer (RNA og DNA); fra til g/kg fosfor; opptil mg/kg jern; og opptil 1 mg/kg kobber. Spesielt foretrukket vil biomassen omfatte fra 68 til 73 %, f.eks. omtrent 70 vekt-% råprotein; fra 9 til 11 %, f.eks. omtrent vekt-% råfett; fra til %, f.eks. omtrent 7 vekt-% aske; fra 8 til 12 %, f.eks. omtrent vekt-% nukleinsyrer (RNA og DNA); fra til 2 g/kg fosfor; opptil 3 mg/kg jern; og opptil 1 mg/kg kobber. Aminosyreprofilen for proteininnholdet kan forventes å være ernæringsmessig fordelaktig med en høy andel av de mer viktige aminosyrene metionin, cystein, treonin, lysin, tryptofan og arginin. Typisk kan disse være til stede i mengder på omtrent 3,1 %, 0,7 %,,2 %, 7,2 %, 2, % og 6,9 %, henholdsvis (uttrykt som en prosent av den totale mengden av aminosyrer). Generelt vil fettsyrene omfatte hovedsakelig den mettede palmitinsyre (ca. 0 %) og den enumettede palmitoleinsyre (ca. 36 %). Mineralinnholdet av produktet vil typisk omfatte høye mengder av fosfor (omtrent 1, vekt-%), kalium (omtrent 0,8 vekt-%) og magnesium (omtrent 0,2 vekt- %).

9 8 2 3 Typisk vil den resulterende biomassen bli produsert i form av en flytbar vandig masse eller oppslemming. Generelt vil dette bestå hovedsakelig av helcelle-materiale, selv om en andel av oppbrudt cellemateriale også kan være til stede. Produktet fra fermentoren kan anvendes direkte (dvs. uten ytterligere prosessering) eller underlegges ytterligere prosesseringstrinn før anvendelse som biomassekomponent ifølge oppfinnelsen. Ytterligere prosesseringstrinn omfatter homogenisering, i tillegg til sentrifugerings- og/eller filtrerings (f.eks. ultrafiltrering)- prosesser for å redusere vanninnholdet før anvendelse. Egnede homogeniseringsmetoder er beskrevet, for eksempel, i WO 01/60974, idet innholdet i denne er omfattet heri ved referanse. Etter produksjon av biomassen blir denne generelt konsentrert fra fermenteringsmediet, for eksempel ved konvensjonelle sentrifugerings- og/eller filtreringsmetoder, f.eks. mikrofiltrering eller ultrafiltrering. Filtrering blir foretrukket utført ved en temperatur i området fra 0 til 70 C. Størrelseseksklusjonen anvendt under ultrafiltrering vil generelt være i området på omtrent 0 kd. Imidlertid kan filtere som har en MW cut-off i området fra til 0 kd, f.eks. omtrent kd, anvendes. Mikrofiltrering vil generelt utføres ved anvendelse av filtere i området fra 0,2 μm til 0,4 μm. Konsentrasjon av biomassen kan utføres ved sentrifugering alene. Under sentrifugering blir innholdet av tørrstoff i biomassen typisk økt fra omtrent 2 til omtrent vekt-%, spesielt til omtrent til 18 vekt-%, foretrukket 8 til %, f.eks. omtrent 14 vekt-%. Om nødvendig, eller faktisk ønskelig, kan filtrerings (f.eks. ultrafiltrering)- metoder anvendes for å ytterligere øke innholdet av fast stoff i biomassen. Ultrafiltrering, som fordelaktig kan utføres ved en temperatur på mellom 40 og 0 C, f.eks. mellom 42 og 46 C, konsentrerer biomassen ytterligere til et produkt som inneholder fra til %, foretrukket fra til 2 %, f.eks. fra 18 til 22 vekt-% encellemateriale. Den resulterende biomassen vil være i form av en vandig oppslemming og vil typisk ha et innhold av fast stoff i området fra til %, foretrukket til 2 %, f.eks. omtrent vekt-%. Biomassen for anvendelse i oppfinnelsen kan også være et hydrolysat eller et autolysat av den mikrobielle kulturen. WO 03/ og WO 03/ beskriver prosesser for fremstilling av bakterielle hydrolysater og autolysater henholdsvis og innholdet deri er inntatt heri i sin helhet. Hydrolyse- og/eller autolysetrinn kan utføres før eller etter ethvert sentrifugerings- og/eller filtreringstrinn. Den nøyaktige rekkefølgen av prosesseringstrinn vil avhenge av den ønskede karakteren av produktet og kan bestemmes av fagfolk på området. Bakterielle hydrolysater kan fremstilles ved virkningen av ett eller flere enzymer i stand til å hydrolysere (f.eks. hydrolytisk nedbrytning) cellestrukturen og/eller

10 9 2 3 intracellulære komponenter av bakteriekulturen, foretrukket et enzym eller enzymsystem i stand til å hydrolysere nukleinsyreinnholdet i cellene. Bakterielle autolysater kan fremstilles ved inkubering av bakterikulturen under nøye kontrollerte betingelser for å tillate de endogene enzymene som finnes i bakteriecellene, slik som nukleaser og proteaser, å kløyve komponentene av cella. Denne "selv-fordøyelses"-prosessen fører til produksjon av forskjellige degraderingsprodukter av cellen som kan omfatte peptider, aminosyrer, nukleotider, fosfolipider, fettsyrer, osv. Passende reaksjonsbetingelser for hydrolyse og autolyse av bakteriekulturen kan bestemmes av fagfolk på området. Biomassen for anvendelse i oppfinnelsen kan også være et permeat, dvs. den oppløselige fraksjonen oppnådd etter filtrering, f.eks. mikrofiltrering eller ultrafiltrering. Et foretrukket permeat oppnås ved homogenisering, autolyse og deretter ultrafiltrering av den bakterielle biomassen. Et annet foretrukket permeat oppnås ved homogenisering og deretter mikrofiltrering av den bakterielle biomassen. For å forbedre utbyttet av produkt, kan hydrolysatet eller autolysatet vaskes gjentatte ganger (f.eks. opptil ganger, f.eks. opptil 3 ganger) med vann etterfulgt av ultrafiltreringstrinn. Etter separasjon av permeatet fra faststoff-fraksjonen holdt tilbake av filteret (heri kalt retentatet) kan faststoff-innholdet i permeatet forventes å være omtrent 1 til 8 vekt-%, f.eks. i området på fra 1 til 3, vekt-%, spesielt omtrent 2 vekt-%, eller i området fra 3 til 8 vekt-%, spesielt omtrent 4, vekt-%. Etter sentrifugering og/eller ultrafiltrering vil biomasse-materialet være en relativt viskøs proteinoppslemming eller pasta. Selv om denne kan anvendes direkte i produktene og fremgangsmåtene beskrevet heri, vil denne vanligvis ble ytterligere prosessert for å fjerne overskytende vann fra produktet. Valget av hvilke(t) som helst ytterligere tørkingstrinn vil avhenge av innholdet av vann i materialet og det ønskede fuktighetsinnholdet av sluttproduktet og kunne bestemmes av fagfolk. Typisk vil produktet bli ytterligere prosessert i overensstemmelse med spraytørkingsteknikker velkjent på området. Den bakterielle biomassen eller bearbeidede biomassen heri beskrevet kan behandles for å redusere nukleinsyreinnholdet av biomassen. Metoder for reduksjon av nukleinsyreinnhold av bakteriell biomasse er kjent på området og omfatter varmesjokkbehandlinger, f.eks. i henhold til metoden beskrevet i Larsen og Joergensen (Applied Microbiology and Biotechnology (1996) 4, s ). En bakteriell biomasse, eller fraksjon derav, behandlet for å redusere nukleinsyreinnholdet er referert til heri som en "nukleinsyre-redusert" biomasse eller biomassefraksjon, henholdsvis. En nukleinsyreredusert bakteriell biomasse omfatter foretrukket nukleinsyrer (målt som innholdet av DNA og RNA i biomasse-materialet relativt til de andre, ikke-løsningsmiddel komponentene) ved et nivå på mindre enn 40 %, foretrukket mindre enn % og spesielt foretrukket mindre enn %, f.eks. ved et nivå på fra til 2 %, av innholdet

11 2 3 av nukleinsyrer i den bakterielle biomassen før nukleinsyrereduksjons-behandling. For eksempel omfatter en nukleinsyre-redusert biomasse i henhold til oppfinnelsen foretrukket et nukleinsyreinnhold på fra 1 til 4 vekt-%, spesielt fra 2 til 3 vekt-%, spesielt omtrent 2,2 vekt-%. Følgelig omfatter egnede derivater av biomassematerialet, for anvendelse i henhold til oppfinnelsen, biomasse avledet fra en kultur omfattende metanotrofe bakterier ved én eller flere av de følgende prosessene: sentrifugering, filtrering (f.eks. ultrafiltrering), homogenisering, hydrolyse og/eller autolyse. Andre egnede derivater omfatter biomassekonsentrater (f.eks. en anriket biomassefraksjon etter sentrifugering og/eller ultrafiltrering), biomasse-permeater (dvs. den løselige fraksjonen oppnådd etter filtrering av biomassen eller biomassefraksjonene) og nukleinsyre-reduserte biomassefraksjoner. Ytterligere egnede derivater omfatter biomasse og biomassederivater dyrket på metanol, spesielt nukleinsyre-reduserte biomassederivater dyrket på metanol. I en foretrukket utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen derfor en biomasse, fiskefôr eller fiskefôrkomponent som heri definert, hvori biomassen er som beskrevet heri, f.eks. avledet fra en kultur omfattende metanotrofe bakterier ved én eller flere av de følgende prosessene: sentrifugering, filtrering (f.eks. ultrafiltrering), homogenisering, hydrolyse og/eller autolyse, eller hvori biomassen er et biomasse-konsentrat, et biomasse-permeat eller nukleinsyre-redusert biomassefraksjon. Med betegnelsen "biomasse avledet fra en kultur av metanotrofe bakterier" menes en næringsgivende kultur av metanotrofe bakterier som definert ovenfor, eller et næringsgivende ekstrakt eller bearbeidet fraksjon av en slik kultur. Med "næringsgivende" menes det at biomassen er egnet for anvendelse som en ingrediens i fiskefôr, f.eks. egnet for delvis erstatning av konvensjonelle fôringredienser slik som fiskemel. Biomassen eller fiskefôret ifølge oppfinnelsen er egnet for forebygging eller forbedring av plante-indusert enteritt hos fisk som lider av nevnte tilstand. Typisk vil biomassen heri beskrevet bli gitt til fisk i kombinasjon med det enterittinduserende plantematerialet, f.eks. i et formulert fiskefôr, og er følgelig foretrukket innblandet i et konvensjonelt fôr inneholdende en planteproteinkilde, f.eks. soyamel. Metoder for å blande fôrkomponenter og tilveiebringe fiskefôr (f.eks. i ekstrudert eller pelletform) er velkjent på området. Foretrukne former for fiskefôr ifølge oppfinnelsen omfatter tørre pelleterte, ekspanderte og ekstruderte former og omfatter også fuktige og halv-fuktige former. Alternativt kan biomassen gis til fisk atskilt fra det enterittinduserende plantematerialet som et supplement til dietten. En fremgangsmåte for fremstilling av fiskefôr eller fôrkomponent i henhold til oppfinnelsen, f.eks. som beskrevet ovenfor, vil generelt omfatte å blande det bakterielle proteinmelet med et plantemateriale som forårsaker enteritt (f.eks. soyamel) og,

12 eventuelt, med én eller flere konvensjonelle fiskefôr-ingredienser. Denne blandingen kan deretter bli ytterligere prosessert. Egnede konvensjonelle ingredienser og fremgangsmåter for fremstilling av fiskefôr og fôrkomponenter er velkjent på området (se også Tabell 2 og Eksempel 4). Sett fra et ytterligere aspekt tilveiebringer oppfinnelsen følgelig en fremgangsmåte for fremstilling av et fiskefôr eller fôrkomponent i henhold til oppfinnelsen, hvilken fremgangsmåte omfatter å blande en biomasse avledet fra en kultur av metanotrofe bakterier og et plantemateriale som forårsaker enteritt (f.eks. soyamel). I en foretrukket utførelsesform omfatter fremgangsmåten å blande nevnte biomasse med én eller flere konvensjonelle fôringredienser. Fisk som kan lide av plante-indusert enteritt omfatter både karnivore og omnivore fisk (selv om graden i hvilken de lider av tilstanden vil avhenge av flere faktorer, inkludert fiskearten, inklusjonsnivået og varigheten av fôring med plantematerialet, osv.). Lidelsen blir typisk observert i løpet av 1 dag til 4 ukers fôring av fisken med plante-avledede fôrstoffer. Typiske inklusjonsnivåer i dietten av plantebaserte materialer som fører til enteritt hos fisk er minst vekt-%, spesielt minst 8 vekt-% og spesielt minst vekt-% (basert på den totale vekten av dietten). Slike verdier kan også bli gitt basert på den totale vekten av protein i dietten og kan være minst vekt-%, foretrukket minst 8 vekt-%, f.eks. i området fra 8 til 40 %, foretrukket til 2 %. Plante-avledede fôrstoffer som kan indusere enteritt er som heri definert, men omfatter soyamel (fullfett og avfettet) så vel som erteproteinkonsentrater og andre materialer som forårsaker enteritt, f.eks. lupinfrø. Det maksimale tolererbare nivået av planteprotein i fôret i henhold til oppfinnelsen vil være avhengig av fiskearten og av nivået av andre komponenter i fôret, spesielt av nivået av biomasse i fôret, men kan lett bestemmes av fagfolk på området. Et konvensjonelt fôr (f.eks. for salmonider) kan, for eksempel, omfatte (med hensyn til vekt): -60 %, f.eks. omtrent %, fiskemel; -3 %, f.eks. omtrent %, fiskeolje; 0-3 %, f.eks. omtrent %, planteproteiningredienser som ikke fører til enteritt; - %, f.eks. omtrent %, planteoljer; - %, f.eks. omtrent %, stivelsesingredienser (f.eks. hvete); og omtrent 1 % av andre komponenter (f.eks. mineraler, vitaminer, fargemidler osv.). Eksempler på slike fôr er gitt i Eksempel 2. I én utførelsesform kan fiskefôret i henhold til oppfinnelsen omfatte (med hensyn til total vekt av fôr): 0-2 %, f.eks. - %, foretrukket omtrent 12 % fiskemel; 1-0 %, foretrukket -40 %, spesielt -2 %, f.eks. omtrent %, bakteriell biomasse som heri definert; og -0 %, f.eks. -40 % eller - %, foretrukket omtrent %, plantemateriale som forårsaker enteritt (f.eks. soyamel). I en ytterligere utførelsesform kan fiskefôret i henhhold til oppfinnelsen omfatte (med hensyn til total vekt av fôr): 0-2 %, f.eks. - %, foretrukket omtrent % fiskemel; 2,- %, foretrukket - %,

13 spesielt - %, bakteriell biomasse som heri definert; og - %, foretrukket - %, plantemateriale som forårsaker enteritt (f.eks. soyamel). Fiskefôret ifølge oppfinnelsen vil typisk omfatte andre komponenter for helse og ernæring av fisk, som for eksempel listet opp ovenfor. Mengdene av disse ytterligere komponentene kan bestemmes av fagfolk. Når fiskefôret er ment for anvendelse for fôring av laks kan dette inneholde minst vekt-% soyamel, f.eks. minst %, minst %, minst % eller minst 2 vekt-% (basert på den totale vekten av dietten). Når fiskefôret er ment for anvendelse for fôring av ørret, kan fôret inneholde minst vekt-% soyamel, f.eks. minst %, minst % eller minst 3 vekt-% (basert på den totale vekten av dietten). Som det vil forstås, når andre proteiningredienser er til stede i det endelige fôret og den bakterielle biomassen ikke er ment å gi noe signifikant bidrag til proteininnholdet av fiskedietten, er det foretrukket at denne skulle anvendes i relativt lave mengder forutsatt at dette er i stand til å oppnå den nødvendige enteritt-reduserende effekten. På den annen side kan, når biomassen er ment å bidra til proteininnholdet av dietten, denne anvendes i større mengder. Den nøyaktige mengden av biomasse som kan anvendes vil naturligvis være avhengig av flere faktorer, inkludert karakteren av plantematerialet som forårsaker enteritt (dvs. graden i hvilken det er ansvarlig for enteritt) og mengden i hvilken det er til stede i fôret, karakteren av fiskearten, osv. Ved å ta med i betraktning disse faktorene, kan passende mengder av biomassen lett bestemmes av fagfolk på området. I én utførelsesform kan et fiskefôr ifølge foreliggende oppfinnelse omfatte minst 0, vekt-% bakteriell biomasse (som heri definert), foretrukket minst 0,7 vekt-%, f.eks. minst 1, 1,2, 1,, 2, 2,, 3, 4 eller vekt-%. Et fiskefôr omfattende mellom 1, og 2, vekt-% bakteriell biomasse er spesielt foretrukket. Alternativt er et fiskefôr omfattende mellom 1 og 0 vekt-%, spesielt mellom 2 og 40 vekt-%, f.eks. mellom 2, og %, mellom og % eller mellom og vekt-%, også foretrukket. Et fiskefôr som omfatter mellom og 0 vekt-%, spesielt mellom og 40 vekt-%, bakteriell biomasse er også foretrukket. I en ytterligere utførelsesform kan fiskefôret ifølge foreliggende oppfinnelse omfatte opptil 40 vekt-% enteritt-fremkallende plantemateriale som heri definert (f.eks. soyamel), foretrukket opp til vekt-%. Et fiskefôr omfattende mellom og 40 vekt-% plantemateriale, spesielt mellom og 3 %, f.eks. fra til vekt-%, eller og vekt-% plantemateriale er foretrukket. Et fiskefôr som omfatter mellom 2, og vekt-% bakteriell biomasse og mellom og vekt-% enteritt-fremkallende plantemateriale som heri definert (f.eks. soyamel) er spesielt foretrukket. Forholdet mellom plantemateriale (f.eks. soyamel) og bakteriell biomasse i fôr heri beskrevet er foretrukket mellom 1: og :1, foretrukket mellom 1: og :1, mellom 1:3 og 3:1 eller 1:2 til 2:1, spesielt foretrukket omtrent 1:1. I en alternativ

14 utførelsesform, kan forholdet mellom plantemateriale og biomasse i fôrene heri beskrevet være mindre enn 80:1, foretrukket mindre enn 40:1, f.eks. mindre enn 16:1. For eksempel kan passende forhold være 8:1 til 1:4, foretrukket 4:1 til 1:3, spesielt 3:2 til 2:. I en alternativ utførelsesform kan forholdet mellom plantemateriale og biomasse i fôrene heri beskrevet være 2:1 til 2:1, spesielt omtrent 4:1. Et foretrukket forhold mellom plantemateriale (f.eks. soyamel) og biomasse i fôrene heri beskrevet er mindre enn 8:1, spesielt mindre enn 4:1, f.eks. mellom 4:1 og 1:1, spesielt omtrent 2:1. I den utførelsesformen ifølge oppfinnelsen hvor den bakterielle biomassen gis som del av en fôrkomponent, kan de relative mengdene av biomasse og enteritt-fremkallende plantemateriale være lik de vist ovenfor hva angår de ovennevnte fôr, dvs. hvor ingen ytterligere biomasse eller plantemateriale er gitt i det endelige fôret (og følgelig vil forholdet mellom nevnte komponenter i det endelige fôret være likt det i fôrkomponenten). Alternativt kan de relative mengdene av biomasse og plantemateriale i fôrkomponenten være slik at inklusjon av nevnte komponent i det endelige fôret fører til forholdene beskrevet ovenfor. I en spesielt foretrukket utførelsesform er forholdet mellom plantemateriale (f.eks. soyamel) og biomasse i fôrkomponenten :1 til 1:4, foretrukket 8:1 til 1:3. Foretrukket fôrkomponent kan omfatte et forhold mellom enterittfremkallende plantemateriale og biomasse på omtrent :1 eller på omtrent 4:1, et forhold på :1 er spesielt foretrukket. I en alternativ utførelsesform omfatter en foretrukket fôrkomponent et forhold mellom enteritt-fremkallende plantemateriale og biomasse på mellom 4:1 og 1:1, f.eks. omtrent 4:1, omtrent 2:1 eller omtrent 3:2. Spesielt foretrukket i overensstemmelse med oppfinnelsen er en fôrkomponent som omfatter omtrent vekt-% bakteriell biomasse og omtrent 90 vekt-% enterittfremkallende plantemateriale. Også foretrukket i overensstemmelse med oppfinnelsen er en fôrkomponent som omfatter omtrent vekt-% bakteriell biomasse og omtrent 80 vekt-% enteritt-fremkallende plantemateriale (f.eks. soyamel), eller som omfatter omtrent 3 vekt-% bakteriell biomasse og omtrent 6 vekt-% enteritt-fremkallende plantemateriale. Det er omfattet at det plantebaserte materialet heri beskrevet vil bli anvendt som en erstatning for fiskemel eller andre ikke enteritt-fremkallende proteinkilder i fiskefôr. Følgelig tilveiebringer oppfinnelsen videre et fiskefôr med et redusert fiskemelinnhold, karakterisert ved at noe av eller alt fiskemel er erstattet av et enteritt-fremkallende plantemateriale og en bakteriell biomasse som heri definert. Foretrukket er plantematerialet som definert i det foregående og er spesielt foretrukket soyamel. Foretrukket kan minst 0 % av fiskemelet være erstattet, f.eks. minst 7 %, minst 8 % eller minst 9 %. Selv om fremgangsmåtene heri beskrevet er anvendelige for hvilken som helst fisk mottagelig for plante-indusert enteritt, angår foreliggende oppfinnelse spesielt

15 14 2 karnivore fisk, spesielt salmonider (av familien Salmonidae) og spesielt laks, f.eks. Atlanterhavslaks (Salmo salar), kongelaks (Oncorhynchus tshawytscha) eller sølvlaks (Oncorhynchus kisutch); ørret, f.eks. regnbueørret (Oncorhynchus mykiss); en av flere arter i slekten Salvelinus, f.eks. røye (Salvelinus alpinus); fisk i slekten Coregonus, f.eks. sik (Coregonus lavaretus); harr, f.eks. Thymallus thymallus; og stor ravfisk ("amberjack"), f.eks. Seriola dumerili. Oppfinnelsen er også anvendelig for brasme, f.eks. gyllenhodet havkaruss (Sparus aurata Linn.) og "sea bream"; karpe, f.eks. vanlig karpe (Cyprinus carpio); torsk, f.eks. Atlantisk torsk (Gadus morhua); kveite, f.eks. Atlantisk kveite (Hippoglossus hippoglossus); piggvar, f.eks. europeisk piggvar (Psetta maxima); havabbor (f.eks. asiatisk havabbor); tilapia, f.eks. av slekten Oreochromis; og malle, f.eks. kanalmalle (Ictalurus punctatus) og medlemmer av familien Pangasiidae (f.eks. Pangasius bocourti). Oppfinnelsen vil nå bli beskrevet mer detaljert i de følgende ikke-begrensende eksemplene og med henvisning til de ledsagende figurene i hvilke: Figur 1 viser tverrsnitt av tarmveggene i distal del av tarmen hos Atlantisk laks fôret i overensstemmelse med fremgangsmåten i Eksempel 4. Figur 1A er en prøve fra en fisk fôret med en diett omfattende 13 vekt-% fiskemel, vekt-% soyamel og vekt-% bakterielt proteinmel (og som ikke viser noen tegn på enteritt). Figur 1B er en prøve fra en fisk fôret med fiskemeldiett omfattende 41 vekt-% fiskemel og vekt-% soyamel (og ikke noe bakterielt proteinmel) som fremviser en morfologi svært karakteristisk for soyaindusert enteritt. Figur 2 viser en gradering av leukocyttakkumulering i lamina propria fra tarmveggen i distal del av tarmen hos Atlantisk laks fôret i overensstemmelse med fremgangsmåten i Eksempel. Figur 3 viser en gradering av epitel fra tarmveggen i distal del av tarmen hos Atlantisk laks fôret i overensstemmelse med fremgangsmåten i Eksempel. Figur 4 viser en gradering av tarmens folder (redusert atrofi) fra tarmveggen i distal del av tarmen hos Atlantisk laks fôret i overensstemmelse med fremgangsmåten i Eksempel. Figur viser en gradering av nivåer av ødem i distal del av tarmen hos Atlantisk laks fôret i overensstemmelse med fremgangsmåten i Eksempel. Eksempel 1 - Fiskefôrkomponenter 3 Tabell 1 viser typiske sammensetninger av forskjellige ingredienser som kan formuleres for fremstilling av fiskefôr:

16 Tabell 1 Ingredienser, g kg -1 Råprotein Tørrstoff Aske Rå lipider Stivelse Fiskemel Hvete Soyamel Bakterielt proteinmel 677,0 913,24 127,48 80,48,80 134,63 861,9 13,18 13,43 98,00 44,6 881,36 8,02 9, 4,00 66,2 921,27 6,00 9,6,00 Eksempel 2 - Komplette fiskefôr Tabell 2 viser formuleringen av forskjellige dietter for fisk. Diett 1 er en fiskemel (FM)- diett; diett 2 er en % avfettet soyamel (SBM)-diett; og diett 3 er en kombinasjon av 13 % fiskemel, % avfettet soyamel og % bakterielt proteinmel (BPM)-diett (% er med hensyn til vekt basert på den totale dietten). Diett 3 er i overensstemmelse med oppfinnelsen. Tabell 2 Hovedingredienser, g kg -1 Fiskemel 1 Bakterielt proteinmel 2 Avfettet soyamel 3 Fiskeolje 4 Hvete Vitamin, mineral, markør og astaxanthinblanding FM-diett SMB-diett BPM-SMB-diett 91, ,0 170,0,6 412,4-0,0 224,0 8,0,6 127,4 0,0 0,0 216,0 1,0 1 Norse LT-94, lav-temperatur tørket fiskemel (Norsildmel, Bergen, Norge).,6 2 BioProtein (Norferm AS, Stavanger, Norge). 3 Ekstrahert og toastet soyamel (Denofa, Fredrikstad, Norge). 4 Silfas, Karmsund, Norge. Per kg diett: vitamin A: 0 IU; vitamin D 3 : 00 IU; vitamin E: 0 mg; vitamin K 3 : mg; vitamin B 1 : mg; vitamin B 2 : 2 mg; vitamin B 3 : 7 mg; vitamin B : mg; vitamin B 6 : mg; vitamin B 9 : mg; vitamin B 12 : 0,02 mg; vitamin C: 12 mg; biotin: 0,2 mg; Ca: 1,1 g; Zn: 1 mg; Mn: mg; Cu: mg; Co: 1 mg; I: 3 mg; astaxanthin: 17 mg (F. Hoffmann-La Roche, Basel, Sveits); Yttriumoksid 99,9 % renhet: 0 mg (Metal Rare Earth Limited, Shenzhen, Guangdong, Kina). 2 Eksempel 3 - Komplette fiskefôr

17 16 Tabell 3 viser formuleringen av forskjellige dietter for fisk. FM-dietten er en høykvalitets fiskemeldiett. Diettene 1-6 er i overensstemmelse med oppfinnelsen og omfatter varierende nivåer av bakterielt proteinmel og en fast mengde avfettet soyamel som blir anvendt for å erstatte, delvis, fiskemel-komponenten av FM-dietten. Tabell 3 Hovedingredienser, g kg -1 FMdiett Diett 1 Diett 2 Diett 3 Diett 4 Diett Diett 6 Fiskemel 1 642,4 49,4 436,4 412,4 364,4 316,4 269,4 Bakterielt proteinmel Avfettet soyamel Fiskeolje Hvete Vitamin, mineral, markør og astaxanthinblanding,6,6,6,6,6,6,6 Eksempel 4 - Fôringsstudie 2 Dietter Tre dietter ble formulert i overensstemmelse med Tabell 2 fra Eksempel 2. Disse omfattet: en kontrolldiett basert på høykvalitets fiskemel (FM-diett), en diett med 0 g kg -1 avfettet soyamel (SBM-diett) og en diett inneholdende en kombinasjon av 0 g kg -1 bakterielt proteinmel (BPM) og 0 g kg -1 SBM (BPM- SBM-diett). BPM og SBM ble anvendt til å erstatte FM og mengden av hvete og fiskeolje i hver diett ble endret for å tilveiebringe dietter med et tilnærmelsesvis likt forhold mellom råprotein, rå lipider og stivelse. Tilsetningen av vitaminer og mineraler var konstant for alle diettene, og yttriumoksid ble anvendt som ufordøyelig markør for bestemmelse av tilsynelatende fordøyelighet av næringsstoffer. Diettene ble fremstilt ved ekstrusjonsteknologi ved Center for Feed Technology, Ås, Norge. Alle tørre ingredienser ble malt i en Münch hammer mill (HM 21.1, Wuppertal, Tyskland) med en 1 mm sikt. Melblandingene ble kondisjonert (97 ± 1,9 C; 26 ± 1,4 % fuktighet (gjennomsnitt ± S.E.M.)) i en dobbel skaft kondisjonerer (BCTC, Buhler, Uzwil, Sveits) før ekstrudering (1 ±,9 C ved matrise) ved en fem seksjon Buhler twin-screw ekstruder (BCTG 62/ D, Buhler, Uzwil, Sveits) med en 3 mm matrise. Fisk og oppdrettsbetingelser

18 17 Fiskeforsøket ble utført ved AKVAFORSK, Sunndalsøra, Norge, med Atlanterhavslaks (Salmo salar) med en gjennomsnittlig initiell vekt på 133, g. Hver diett ble gitt til tre grupper av fisk holdt i 1 m 3 fiberglasstanker forsynt med sjøvann (8,6 C; 32, g kg -1 salinitet). Fôringsforsøket varte i 80 dager. Alle tanker hadde lys 24 timer per dag og diettene ble gitt hvert. min, 24 timer per dag, ved anvendelse av elektrisk drevne plate doseringsapparater. Uspist fôr ble siktet fra utløpsvannet fra hver tank og fôr-inntaket ble kontrollert. Siden den kommersielle dietten anvendt til å ale opp fisken kunne ha inneholdt soyamel, ble all fisk gitt FM-dietten i minst fire uker før forsøket for å unngå ulike interaksjoner med de eksperimentelle diettene inneholdende soyamel. Fire ukers forhånds-fôring anses å være tilstrekkelig for en fullstendig restituering av tarmens folder, dersom de er skadet. 2 Veing og prøvetaking for analyse Tilfeldige prøver av de individuelle proteinrike fôr-ingrediensene og fôr ble malt og frosset før kjemisk analyse. Fisken ble bulk-veid ved start av forsøket, og individuelt veid ved slutten av forsøket (dag 80). Ved avslutning ble fem fisk fra hver tank plukket ut tilfeldig for oppsamling av organer for histokjemisk evaluering. Tarmkanaler fra fem fisk fra hver tank ble dissekert for histologisk undersøkelse av vev fra tarmvegg fra pylorus ("pyloric caeca") og fra midttarm og distal del av tarmen. Prøver på omtrent x mm ble oppnådd fra midtre del av tarm-bitene og fiksert i 4 % fosfatbufret formaldehyd ( % formalin). Formalinfiksert vev ble rutinemessig dehydrert i etanol 48 timer før prøvetaking, ekvilibrert i xylen og innstøpt i parafin i henhold til standard histologiske teknikker. Snitt på omtrent μm ble kuttet og farget med hematoksylin og eosin før undersøkelse under lysmikroskop. Intestinal morfologi ble evaluert i henhold til følgende kriterier beskrevet for soyamel-indusert enteritt hos Atlanterhavslaks (Baeverfjord og Krogdahl, supra): (1) utvidelse og forkortelse av tarmens folder; (2) tap av normal supranukleær dannelse av vakuoler i de absorptive cellene (enterocyttene) i tarmmukosa; (3) utvidelse av sentral lamina propria i tarmens folder, med økt mengde av bindevev; og (4) infiltrasjon av en blandet leukocyttpopulasjon i lamina propria og submukosa. 3 Kjemiske og biokjemiske analyser Tørrstoff, råprotein (Kjeldahl N x 6,2) og aske ble analysert i henhold til standardmetoder ifølge AOAC International, US (AOAC, 1990), rå lipid ble bestemt etter hydrolyse med petroleumseter i en Accelerated Solvent Extractor (ASE0) fra Dionex (Sunnyvale, CA, USA), og stivelse (Total Starch Assay Kit [AA/AMG], Megazyme

19 18 International Ireland Ltd., Wicklow, Irland) bestemt som total glukose etter hydrolyse med glukosidase. Beregninger og statistiske analyser Fôrinntak for en periode ble beregnet som DM feed x BW -1 0, hvor DM feed er forbruk av fôrtørrstoff og BW 0 representerer den initielle kroppsvekten (tank gjennomsnitt) for perioden. Termisk vekstkoeffisient ble beregnet som 00 x (BW 1/3 1 - BW 1/3 0 ) / d, hvor BW 1 representerer den endelige kroppsvekten og d representerer termisk sum (gjennomsnittlig daglig temperatur x dager av perioden). Fôrutnyttelse ("feed conversion ratio") (FCR) ble beregnet som DM feed x (BW 1 - BW 0 ) -1. Statistiske analyser ble utført ved anvendelse av JMP fra SAS Institute Inc. Signifikante (P<0,0) forskjeller mellom gjennomsnittsverdier ble rangert. Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± gjennomsnittets standardfeil (s.e.m.). Resultater Tabell 4 viser analysert kjemisk sammensetning av de forskjellige diettene. Tabell 4 Tørrstoff(DM), g kg -1 Kjemisk sammensetning g kg -1 DM Råprotein Råfett Stivelse Aske Brutto energi, MJ kg ,2 SMB-diett , FMdiett 91 BPM-SMBdiett ,6 Tabell viser gjennomsnitt basert på minste kvadraters metode ("least-square means") for fôrinntak, vekst og fôrutnyttelse (n=3). Tabell Diett FMdiett SBMdiett BPM- SBM-diett Samlet s.e.m. P- verdi Fôrinntak, g DM (kg initiell ,1 0,060 vekt) -1 Gjennomsnittlig vekt, g fisk -1 Start Slutt 133 b 132 a 13 c 0,2 362 b 319 a 328 a 8,0 <0,001 0,0 0,076 0,017

20 19 Termisk vekstkoeffisient (TGC) 2,90 b 2,49 a 2,3 a Fôrutnyttelse, g DM 0,72 a 0,76 b 0,7 b 0,007 0,011 Inntak (g kroppsvektøkning) -1 a,b,c Forskjellige bokstaver i hevet skrift innenfor en rad angir signifikante (P<0,0) forskjeller mellom diett-behandlinger. Tabell 6 viser resultatene av en visuell klassifisering fra histologi av snitt av distal del av tarmen. Tabell 6 Diett Klassifisering av distal tarm (Ant. fisk av ) Normal tarm Mindre inflammasjon Moderat til alvorlig inflammasjon 0 0 SMB-diett 0 0 FMdiett BPM-SMBdiett 0 0 Figurene 1A og 1B viser tverrsnitt av tarmvegger fra fisk fôret med BPM-SBM-dietten (Fig. 1A) og fisk fôret med SBM-dietten (Fig. 1B). Legg merke til de utvidede foldene i tarmen med økt cellularitet i subepitelt vev hos fisk fôret med SBM-dietten sammenlignet med fisk fôret med BPM-SBM-dietten. Konklusjoner Morfologiske studier av distal del av tarmen viser at det bakterielle proteinmelet (BPM) forebygger soya-indusert enteritt. Eksempel - Fôringsstudie 2 Dietter Sju dietter ble formulert som beskrevet i Tabell 3; en fiskemel (FM)-basert kontrolldiett og seks dietter med inklusjon av 0 g soyamel (SBM) per kg fôr og økende mengder av bakterielt proteinmel (BPM). Diettene ble fremstilt ved anvendelse av ekstruderingsteknologi som tidligere beskrevet og ble vakuum-overtrukket med fiskeolje. De resulterende fôrpellets var omtrent 3, mm i diameter. Fisk og oppdrettsbetingelser Atlanterhavslaks (Salmo salar) med en omtrentlig gjennomsnittlig initiell vekt på 273 g ble tilfeldig fordelt til 14 tanker med 0 fisk i hver tank. Tankene ble forsynt med