Sensorveiledning -1-1

Transkript

1 Embedseksamen i Medisin, Odontologi og Ernæring Andre semester (cellebiologi) kull H05 Torsdag 15/6-2006, Kl Oppgavesettet utgjør totalt 100 vekttall. Antall vekttall er vist i parentes foran hver spørsmålsgruppe. Kreft i bukspyttkjertelen er en relativt vanlig kreftsykdom med ekstremt dårlig prognose. Rasproteinet (oftest bare kalt Ras), som inngår i Ras-MAPK signalveien, er hyppig mutert ved denne kreftformen. En norsk forskergruppe har prøvd ut vaksinering med Ras-peptider hos pasienter med langtkommen kreft i bukspyttkjertelen. Peptidene var konstruert slik at de hadde samme mutasjoner som i pasientenes svulster. A. (21) Bukspyttkjertelen (Pankreas) er både en eksokrin og en endokrin kjertel. 1. Hvilken type vev er kjertler som hovedregel bygget opp av? Svar: Både endokrine og eksokrine kjertler består som hovedregel av epitelvev. (Organene er på forsterstadiet dannet fra epiteloverflater ved nedvekst i underliggende bindevev. Eksokrine kjertler har bevart en epitelforbindelse til overflaten (utførselsgang), endokrine kjertler har ikke utførselsgang, men er istedet gjennomboret av blodkar med svært sparsomt omkringliggende bindevev. 2. Serøse og mukøse spyttkjertelceller har forskjellig lysmikroskopisk utseende. Nevn eller vis ved tegning de viktigste forskjellene vi ser ved vanlig H+E (hematoksylin + eosin) farging. Svar: Mukøse celler har blekt cytoplasma. Kjernene er små, mørke, perifert (basalt) lokaliserte og ofte flate/avlange. Serøse celler har kraftigere farget cytoplasma med synlige korn; kjernene er runde, lysere og ofte mer sentralt plasserte i cellen. (Mukøse cellers cytoplasma er fylt opp av vesikler med produktet mucin, et glykoprotein med svært mange og lange karbohydratkjeder. Disse har lite ladning, og farges dårlig i H+E, noe som gir blekt cytoplasma. Serøse celler inneholder vesikler med forskjellige proteiner med mindre grad av glykosylering. Disse farges bedre, og kan ses som sekretkorn i cytoplasma.) 3. Spyttsekresjon er et eksempel på regulert sekresjon. Hvilke ultrastrukturelle (elektronmikroskopiske) trekk er karakteristiske ved f.eks. serøse spyttkjertelceller. Svar: Alle celler som eksporterer protein i stor mengde har en kjerne med tydelig nucleolus. (Kromatinstrukturen varierer, dels avhengig av hvor mange ulike proteiner som produseres.) I cytoplasma finner man et høyt antall ribosomer i på overflaten av endoplasmatisk retikulum, også kalt rer (ru endoplasmatisk retikulum). (Man kan også se flere Golgi-apparater). Siden sekresjonen er regulert, vil transportvesiklene med eksportproteinene lagres i cytoplasma i påvente av et signal. Dermed vil det observeres tallrike sekretvesikler, noe man ikke ser ved konstitutiv sekresjon (f.eks. plasmacelle).. Immunsystemet informeres kontinuerlig om hva som foregår av proteinsyntese inne i kroppens celler ved at peptider dannet ved nedbryting i cytosol sendes via endoplasmatisk retikulum til celleoverflaten, bundet til spesielle rapporteringsproteiner. Da kan immunsystemet oppdage tumorceller med muterte Ras-proteiner. -1-1

2 4. Beskriv hovedmekanismen for nedbryting av proteiner i cytosol, inklusive hvordan cytosolproteiner merkes for nedbryting. Svar: Degradering i proteasomet. Dette er en sylinderformet struktur, med flere proteolytiske enzymer (proteaser), som alle har det aktive setet vendt inn mot hulrommet i sylinderen. Dette sikrer at bare proteiner som har entret proteasomet blir brutt ned. Proteiner som skal brytes ned blinkes ut ved at de får festet på seg proteinet ubikvitin (Ub) (vanligvis i form av en kjede med flere ubikvitiner etter hverandre). Ubikvitinkjeden bindes til reseptor ved inngangen av proteasomsylinderen og formidler transport av proteinet inn i sylinderen. 5. Hva er det som bestemmer hvilke proteiner som merkes for nedbrytning? Svar: Ubikviteringen skjer ved at et ATP-avhengig Ub-aktivererende enzym (E1) først hekter Ub på et nytt enzym (E2), som overfører Ub til målproteiner. Det er mange ulike E2. Noen virker alene, de fleste virker sammen med et tredje protein, E3, som det også er mange ulike utgaver av. De mange ulike ubikvitin-ligasene er nødvendig fordi mange ulike degraderingssignaler skal gjenkjennes. Hvilke proteiner som skal brytes ned avhenger dels av hvilke ubikvitin-ligaser som er aktive i cellen, dels av ulike typer degraderingssignaler eksponert av proteinene. Ras er bundet til cytosolsiden av cellemembranen. 6. Gi en kort oversikt over ulike typer forankring av proteiner til membraner. Hvordan er Ras festet til cellemembranen? Svar:a) Transmembranproteiner (enkeltpasserings- eller multipasserings TM-proteiner). b) Lipidankre, enten via glykosylfosfatidylinositol- (GPI-) forankring (utsiden av membranen), eller vha. direkte bundne hydrokarbonkjeder (som f eks palmitinsyre) (innsiden av membranen). c) Noen proteiner har apolar flate som er innleiret i det ene lipidlaget av membranen. d) Noen proteiner er bundet til andre proteiner som er festet vha a, b eller c. Ras er festet ved hjelp av et lipidanker. Når kreftceller invaderer underliggende vev observeres som regel betydelige endringer i cellecelle og celle-matriks adhesjoner. 7. Beskriv minst 3 forskjellige grupper av adhesjonsmolekyler. Hva er deres viktigste funksjoner? Svar: Cadheriner. Homofile bindinger involvert i celle-celle-adhesjon Integriner. Celle-celle og celle-matriks adhesjon i heterofile bindinger Selektiner. Celle-celle adhesjoner i heterofile bindinger Immunglobulinfamilien. Celle-celle bindinger (homofile og heterofile) 8. Mange adhesjonsmolekyler kan samles og etablere "spesialiserte cellekontakter". Beskriv kort struktur og funksjon til disse. Svar: Jeg vil her fram til de cellekontaktene der de beskrevne adhesjonsmolekylene i forrige oppgave danner store "clustere". Endel studenter vil trolig inkludere tight og gap junctions i besvarelsen. Dette er strengt tatt ikke helt riktig, men bør ikke telle negativt i en besvarelse. Adherensbelter. Cadheriner i homofile bindinger. Binder celler sammen. Festet til actin intracellulært Desmosomer. Cadheriner i homofile bindinger. Binder celler sammen. Gir vev stor strekkstyrke. Festet til intermediærfilamenter intracellulært. -2-2

3 Hemidesmosomer. Integriner adherert til basalmenbran. Intracellulært bundet til intermediærfilamenter Fokale kontakter. Integriner festet til matriks. Bundet til aktin intracellulært B (21) Hos en pasient med kreft i bukspyttkjertelen gjorde man en RFLP analyse av et PCR-produkt fra et Ras-gen hvor man brukte restriksjonsenzymet PstI. Resultatet av denne PCR-RFLP undersøkelsen analysert på DNA isolert fra henholdsvis blod og svulstvev er skjematisk vist i figuren. Firkantene øverst viser brønnene i agarosegelen og elektroforeseretningen er fra topp mot bunn. Bp=basepar. 9. Redegjør for prinsippene ved en PCR-RFLP undersøkelse og hva en slik undersøkelse kan brukes til. Hvilken informasjon får du fra gelbildet? Hva er PCR-RFLP? 1. Svar: Hva er PCR-RFLP? Restriksjons-endonukleaser er enzymer som gjenkjenner og kutter dobbelttrådig DNA i spesifikke sekvenser. Det er vist at enkelte steder i genomet vil det forekomme variasjoner i sekvensen som avgjør om en restriksjonendonuklease vil kutte eller ikke. Dette kaller vi en restriksjons fragment lengde polymorfisme (RFLP). Når en RFLP analyseres ved at man tilsetter restriksjonsendonukleasen til et PCR produkt (i motsetning til f.eks. vanlig genomisk DNA) kalles det PCR-RFLP. Studentene forventes å også gi en kort beskrivelse av hva PCR er uten at det forventes at de gir en detaljert gjennomgang av dette. Følgende definisjon anses tilstrekkelig. Polymerase kjede reaksjon (PCR) er en reaksjon som øker mengden av en spesifikk del av DNA. For en PCR tilsetter man to oligonukleotider (primere), som binder seg på hver sin DNA-tråd (etter denaturering), sammen med DNA polymerase og nukleotider. Primerene initierer syntese i retning av den andres bindingssted. Derfor må bindingsstedene for de to primerene være lokalisert i nærheten av hverandre. Produktet som dannes kan fungere som templat når man gjentar syklusen. Syklusen gjentas mange ganeger -3-3

4 (25-35). Oligonukleotidene bestemmer hvilken spesifikk del av DNA som øker i mengde. Mange vil sikkert gi en mer detaljert omtale av prinsippene bak PCR. Hva kan metoden brukes til? Svar: Metoden kan brukes til å påvise polymorfismer og mutasjoner. Polymorfisme- og mutasjonsbestemmelse kan brukes til bl.a. genetisk diagnostikk, identifisering (rettsmedisin) og til å gentypebestemme genetiske markører i koblingsstudier. Informasjon fra gelbildet: Svar: PCR-fragmentet fra svulstvevet inneholder DNA som lar seg kutte med restriksjonsenzymet. Ved sammenligning av de to sporene i gelbildet kan det slås fast at det mutante allelet kun detekteres i svulstvevet. En somatisk mutasjon i svulstvevet kan forklare dette funnet. 10. PCR-RFLP undersøkelsen viste i dette tilfellet at det var en mutasjon i Rasgenet i svulstvevet. Mutasjonen fører til at en G er blitt til en T i en proteinkodende del av Ras-genet. På hvilke måter kan dette påvirke aminosyresammensetningen av Rasproteinet? Svar: Mutasjonen kan være uten effekt på genproduktet (et kodon endres til et annet kodon som koder for samme aminosyre) = sense mutasjon Mutasjonen kan føre til at en aminosyre byttes ut med en annen i proteinet = missense Mutasjon. Mutasjonen kar føre til et prematurt stop-kodon. Nonsense mutasjon I tillegg kan man tenke seg at mutasjonene kan føre til endringer av spleise-seter = spleisemutasjoner 11. Gjør punktvis rede for DNA-replikasjon i eukaryote celler. Svar: Følgende elementer bør være med i en besvarelse: DNA-replikasjonen foregår i S-fasen av cellesyklus En rekke proteiner er med på å finne startstedene for replikasjonen og å initiere replikasjonen DNA-helikaser og DNA-topoisomeraser Multiple startsteder for replikasjonen Replikasjonsgaffel Leading strand og lagging strand En kort RNA tråd lages og fungerer som primer for DNA-polymerasen DNA-polymeraser katalyser polymerisering i 5 - til 3 -retning Okazaki-fragmenter på lagging strand DNA-ligase Korrekturlesning ved hjelp av 3 - til 5 -exonukleaseaktivitet Endene av kromosomene replikeres ved hjelp av telomeraser 12. Beskriv forskjellige mekanismer for DNA-reparasjon. Svar: Følgende mekanismer bør beskrives: Korrekturlesning ved hjelp av 3 - til 5 -exonukleaseaktivitet til DNA-polymerasen Base excision repair Nucleotide excision repair Mismatch repair -4-4

5 Dobbeltbrudd på DNA er nevnt på forelesningene, men det er ikke forventet at studentene skal gjøre rede for mekanismene for non-homolog og homolog end-joining. C (11) Ras-MAPK er en spesiell cellulær signalvei som fra ekstracellulære hormoner og vekstfaktorer regulerer ulike funksjoner i cellen. 13. Beskriv Ras-MAPK-signalveien, inkludert mekanismer som fører til inaktivering av signalveien. Svar: Reseptorene som virker på Ras-MAPK veien er transmembranproteiner med bindingssete på plasmamembranens utside, et enkelt transmembrandomene og intracellulære tyrosin-spesifikke protein-kinasedomener. Aktivering av systemet foregår ved binding og dimerisering av reseptoren, med aktivering av tyrosinkinaseaktiviteten. Intracellulær autofosforylering av kinasedomenene fører så til binding av adapter- og aktivatorproteiner fra cytosol. Dette membranassosierte komplekset kan virke sammen med Ras som er assosiert via lipid med plasmamembranen, inaktivt Ras (med GDP bundet) blir overført til aktiv form ved å bytte ut GDP med GTP. Aktivt Ras binder til en protein kinase som sekvensielt aktiverer flere protein-kinaser i en fosforyleringskaskade, målet er mitogenaktivert protein-kinase (MAPK) som i sin tur påvirker ulike proteiner, deriblant genregulatoriske proteiner som kan påvirke DNA i cellekjernen. Systemet slåes av ved: a) diffusjon av hormon/vekstfaktor vekk fra reseptor, b) defosforylering av tyrosinfosfatene på reseptorkinasene via tyrosinspesifikke fosfataser, c) defosforylering av GTP på aktivert Ras til GDP, stimulert av GAPer ( GTPase-activating proteins ), d) defosforylering av protein-kinasekaskaden og av MAPK via protein fosfataser. 14. Hvordan kan denne signalveien også regulere andre cellulære signalsystemer? Svar Multiproteinkomplekser, GTP-bindende proteiner eller aktiverte/inaktiverte protein-kinaser i denne signalveien tillater mulig biokjemisk påvirkning både til og fra andre signalveier. Et spesifikt eksempel er en tyrosinkinase-sensitiv fosfolipase C som ved aktivering av Ras-MAPK-veien kan omgå trimere G- proteinene for å gi påvirkning av DAG og IP3-produksjon. Ras-MAPK signalveien regulerer frisetting av hormoner og nevrotransmittorer. 15. Sammenlign cellulære mekanismer som er ansvarlige for syntese og lagring av nevrotransmittorer i nerveterminaler med mekanismer som fører til lagring av peptidhormoner i sekretoriske blærer. Svar: Små, klassiske nevrotransmittorer (som for eksempel acetylkolin) blir syntetisert ute i nerveterminalen av enzymer som er transportert ut fra cellesoma. Slike transmittorer blir deretter lagret lokalt i sekretoriske blærer ( synaptiske vesikler ) ved hjelp av koplete transportmekanismer, disse blir igjen drevet av en protongradient over -5-5

6 vesikkelmembranen som blir fremskaffet av en vesikulær H+-ATPase. I motsetning til dette blir peptidhormoner forberedt og pakket i sekretoriske blærer inne i Golgi-apparatet. Disse blærene blir så transportert til de områder i cellene der eksocytosen skal foregå. D (3) I nyere studier av Ras er det anvendt transgene mus som har fått Ras-genet inaktivert. 16. Beskriv hovedtrinnene for å lage knock-out mus. (Punkt 6.5 i SHFs hefte. Henvisning til essential (2nd ed., fig , s. 358 og tilhørende tekstsider) 1 INNFØRING (ved elektroporasjon) AV MÅLSPESIFIKT TRANSGEN I EMBRYONALE STAMCELLER (ES-CELLER) Det lages et DNA-konstrukt ( et transgen) som på mange punkter er likt det endogene gen man ønsker å endre. Derved oppstår mulighet for målspesifikk integrasjon av transgenet i det endogene gen basert på homolog rekombinasjon.. Denne type transgener vil mange ganger i tillegg inneholder sekvenser som ytterligere vil sette det endogene gen ut av funksjon ( knockout ). Transgenet lages ofte også slik at det blir mulig å selektere for (de få) ES-celler hvor ønsket form for integrasjon har funnet sted. Normalt vil bare ett av de to målgen-allelene bli knocket ut i dette trinn av prosedyren. 2 INJEKSJON AV SELEKTERTE (ENDREDE) ES-CELLER I IKKE-TRANSGENE BLASTOCYSTER (nødvendig ledd i prosedyren for å lage homozygote knockouts ). Derved dannes chimere dyr (4-foreldre dyr, dvs. ett foreldresett for ES-cellene og ett for blastocystcellene). De injiserte blastocyster overføres til egnede vertsmødre. Begge cellesettene tilsammen gir opphav til de somatiske cellene i de chimere fostre / museunger. Noen av musene som blir til på denne måten vil også inneholde kimceller (kjønnsceller) som stammer fra de genendrede ES-cellene. 3 VIDERE AVL FOR Å PRODUSERE MUS SOM HAR KNOCKOUT AV MÅLGENET I BEGGE ALLELER (Detaljer i avlsregimet ble ikke nøye gjennomgått, men er delvis omtalt på figur i essential. Forenklet kan dette oppnås ved krysning mellom heterozygoter og kan gi 25% homozygote knockouts. E (11) Ras ble opprinnelig funnet i et retrovirus som forårsaker kreft i rotte. 17. Kreft er et resultat av flertrinnskarsinogenese. Forklar begrepet, og forklar hvordan mutasjoner i for eksempel Ras- og Bcl2-genene sammen kan bidra til kreftutvikling. Svar: Flertrinnskarsinogenese vil si at kreft skyldes mutasjoner i flere gener. Det vil også si at mutasjoner i flere onkogener og/eller tumorsuppressorgener samarbeider i kreftutviklingen. Et typisk eksempel er mutasjoner i Ras og Bcl2. Ras-mutasjoner fører til at interaksjonen mellom Ras og GAP forhindres, noe som igjen fører til at Ras-bundet GTP ikke hydrolyseres. Dermed blir Ras konstitutivt aktiv, og MAPKene forblir konstitutivt aktivert. Resultatet er at cellenes cellesyklusmaskineri blir aktivert uavhengig av vekstfaktorer, og cellene deler seg ukontrollert. Når cellene i tillegg får mutert sitt Bcl2-gen, for eksempel ved translokasjon til kromosom14, vil dette kunne -6-6

7 føre til økte nivåer av Bcl2. Økte nivåer av Bcl2 forskyver balansen mellom Bcl2 og Bax, og Bax kan ikke lenger åpne porer i ytre mitokondriemembran som svar på et apoptose-signal. Dermed frigjøres ikke cytokrom c, caspasene aktiveres ikke, og cellen går ikke i apoptose. Resultatet av de to mutasjonene gir altså både ukontrollert celledeling og hemmet apoptose, noe som i neste omgang kan øke sjansen for nye mutasjoner, og dermed for kreftutvikling. 18. I mennesker er det DNA-virus og ikke retrovirus som oftest bidrar til kreft. Forklar hvordan DNA-virus kan gi kreft. Du bør involvere tumorsuppressorgener i besvarelsen. Svar: DNA-visrus gir kreft ved at viruset bærer med seg gener som koder for proteiner som ødelegger vertcellens tumorsuppressorproteiner. Vanligvis inaktiveres/ødelegges prb og/eller p53. prb inaktiveres ved at virusproteinet (f.eks E7 i papilloma-virus) binder seg i lommen på prb der E2F vanligvis bindes. Dermed frigjøres E2F konstitutivt, og cellen passerer R-punktet i G1 uavhengig av vekstfaktorsignal. Et annet virusprotein (f.eks. E6 i papilloma-virus) hindrer at p53-proteinet blir stabilisert ved DNA-skade. Dermed øker ikke nivået av p53, noe som i sin tur hindrer at p53 transkriberer de viktige genene p21, Gadd45 og Bax. Mangel på p21 (CKI) gjør at CDKene ikke hemmes og cellesyklus ikke stoppes. Mangel på Gadd45 fører til at DNA ikke blir reparert, og mangel på Bax gjør at cellen ikke går i apoptose til tross for at cellen nå har skadet DNA. Resultatet er at cellen lever videre og deler seg med skadet DNA, noe som kan føre til mutasjoner i flere gener og dermed til kreft. 19. I en kreftcelle kan du finne mutasjoner i Ras-genet, noe som kan føre til at cellene passerer restriksjonspunket (R) i G1 uavhengig av vekstfaktorer. Hva finner du dersom du analyser denne cellen med hensyn på hovedkomponentene i cellesyklusmaskineriet som er involvert i dette R-punktet? Svar: Når en celle har passert R-punktet i G1, betyr det at cellesyklusmaskineriet som er involvert i dette kontrollpunktet er aktivert. Hovedkomponentene i dette maskineriet er cykliner, cyklin-avhengige kinaser (CDKer), hemmere av CDKer (CKIer) og prb. Hvis vi analyserer en celle som har passert R-punktet i G1 vil nivået av de fleste cykliner være høye, nivået av de fleste CKIer vil være lave, og de fleste CDKene vil være aktive. prb vil være fosforylert, og E2F vil være frigjort fra prb. F (11) Noen av cellene i pankreas skiller ut store mengder bikarbonat (HCO 3 - ), Den nøyaktige mekanismen for denne utskillingen er ikke klarlagt, men det er enighet om at en viktig faktor for denne funksjonen er at cellenes innside er negativ i forhold til utsiden. 20. Angi mekanismer og egenskaper ved cellenes yttermembran som bidrar til denne ladningsforskjellen. Gi også en kort forklaring på hvorfor det du angir bidrar til mer negativ innside. Svar: Membranens relativt lave permeabilitet for ioner er selvsagt en forutsetning. To andre faktorer må med: Na/K pumpen (som bruker ATP) pumper 3 Na+ ioner ut samtidig som den pumper 2 K+ ioner inn (gir en netto underskudd på positive ioner inne i cellen som bidrar noe, typisk 20%, til det negative potensialet). Det viktigste er at cellens yttermembraner vanligvis er mer permeabel for K+ enn for Na+, som gir et underskudd av positive ladninger på innsiden når K+ lekker ut pga av konsentrasjons-gradienten. En tredje faktor er mindre viktig: Negativt ladning sitter ofte fast på store proteiner og kan derfor ikke komme ut av cellene. De positive (K+ og Na+) vil -7-7

8 ha større frihetsgrad, og vil derfor hyppigere finne veien ut, og gi en bias for negative ladning på innsiden av membranen. Vekting: Viktig 21. Gi eksempler på at den elektriske spenningen som eksisterer over cellenes yttermembran kan brukes til å frakte små molekyler mot sine konsentrasjonsgradienter. Svar: Generelt anti- eller symporter. Eksempler er Glukose/Na+, Cl- /HCO3-, Na+/H+. I disse tilfeller er drivkraften delvis elektrisk (men også kjemisk) for henholdsvis Na+ og Cl- inn i cellen. Det blir feil å nevne Na/K pumpe eller andre ATP-krevende prosesser. Vekting: Ganske viktig. 22. I reguleringen av utskillelse av bikarbonat (og andre stoffer), er det viktig å vite hvor fort ulike stoffer kan gå fra den ene til den andre siden av membranen. Angi noen av de raskeste og noen av de langsomste transportmetodene vi har over cellenes membraner. Svar: All transport som krever transportproteiner, dvs. uniport, symport og antiport, er av de langsomste. Kanaler, f.eks. ione-kanaler og vannkanaler, er de hurtigste. Diffusjon ved at stoffet oppløses i cellemembranen (gasser, stoffer uten ladning, f.eks. vann) ligger vanligvis mellom de to førstnevnte prosesser i hastighet. Vekting: Ganske viktig. G (11) Mange enzymer, også i den intermediære metabolismen, blir allosterisk regulert. Ett eksempel er isositrat dehydrogenase som katalyserer reaksjonen: Isocitrat + NAD + α-ketoglutarat + CO 2 + NADH H + Figuren under viser hvordan aktiviteten av dette enzymet varierer med økende konsentrasjon av isocitrat. 12 V max V (Aktivitet, µm/min) ADP -ADP [Isocitrat](mM) -8-8

9 23. Hvordan kan allosteriske egenskaper forklare kurveforløpet vist med heltrukket linje i figuren. Svar: To modeller kan forklare Sigmoid kurve: 1. KOSHLANDS modell (også kalt: sekvens- eller induksjonsmodell) 2. MONODS modell (også kalt symmetri- eller likevektsmodell) NB. Bare en modell er nødvendig for bestått besvarelse. Ad.1. Koshlands modell. Modellen foreslår at substratbinding til et aktivt site induserer en konformasjonsendring i protomeren. Konformasjonsendringen vil videre kunne indusere konformasjonsendringer i naboprotomere, siden de henger sammen i et aggregat (kvaternærstruktur), slik at disse omsetter substrat raskere når det binder seg. Disse protomerene kan i sin tur påvirke andre protomere slik at de i sin tur omsetter substrat enda raskere osv. Dette kalles en POSITIV KOOPERATIV EFFEKT. Det forutsettes at det er et aktivt site/protomer. M.a.o. Enzymet blir mer effektivt jo mer substrat som binder seg Ad.2 MONODs modell. Modellen forutsetter : 1. likevekt mellom to former av enzymet. (L = R o /T o ) 2. minst 2 protomere med hvert sitt aktive site. 3. den ene formen binder substrat (Ro), den andre ikke (To) (inaktiv)(aktivt site ikke tilgjengelig pga konformasjonen). 4. symmetri -9-9

10 Man tenker seg at S binder seg til R o, som derved går over i en annen form, R 1. Bindes et S til, får man en form til, R 2. Disse kommer fra R o, og konsentrasjonen av R o synker. For å opprettholde likevekten mellom R o og T o må flere inaktive enzymmolekyler overføres til den aktive form, dvs man øker antall aktive sites med økende mengde substrat. Dette fører til en akselerasjon av aktivitet, og vi får en sigmoid metningskurve, inntil alle aktive sites er i virksomhet, og hastigheten nærmer seg Vmax. Dette kaller Monod en HOMOTROP EFFEKT. (Like molekyler (S) hjelper seg selv). 24. Tilstedeværelse av ADP forskyver kurven mot venstre vist med stiplet linje i figuren over. Hvordan vil du forklare effekten av ADP på kurveforløpet? Svar: Andre molekyler kan påvirke reaksjonshastigheten, V. Disse kalles HETEROTROPE EFFEKTORER (positive og negative). ADP = En POSTIV HETEROTROP EFFEKTOR har tilgjengelige allosteriske sites på R- formen. Blandes enzym og effektor, vil R o overføres til effektor-bundne komplekser. For å opprettholde likevekt mellom R o og T o må flere inaktive enzymmolekyler overføres til aktiv form. Nå er det mange aktive site tilgjengelig for S. Dermed får man en raskt økende sigmoid kurve med økende S. Man når Vmax raskere enn uten effektor. b. Effekt av ADP- Koshlands modell- Man tenker seg at hver protomer har et allosterisk site som kan binde ADP. -10-

11 ADP påvirker enzymets konformasjon slik at det får større affinitet for substrat. Dermed vil V øke. At samme Vmax oppnås med og uten ADP kan forklares ved at Enzym-Substrat komplekset, med og uten ADP, spaltes til Enzym og Produkt med samme hastighet. k k EAS EA + P og ES E + P, (samme hastighetskonstant) Det forventes ikke at studentene skal beskrive begge modellene. Forklaring, med hovedprinsippene, ut fra en modell er adekvat. 25. Hvilken betydning kan denne effekten av ADP ha for metabolismen i mitokondriene? Svar: ADP funger her som en allosterisk aktivator av isositrat dehydrogenase, som er et av enzymene i sitronsyresyklus. Høy intramitokondriell konsetrasjon av ATP kan tenkes å foreligge når energiforbruket er stort (og ATP nivået tilsvarende lavt). Under slike betingelser må sitronsyresyklus aktiveres for å frembringe mer ATP. Den ADPavhengige aktiveringen av isositrat dehydrogenase kan betraktes som en komponent i reguleringen av sitronsyresyklus. H (11) Pankreas skiller ut både glukagon og insulin som integrerer og regulerer den intermediære metabolismen. Til hvert av de påfølgende utsagn er det knyttet tre alternative svar, bare ett av svaralternativene er korrekt. Angi hvilket svaralternativ du mener er korrekt, og begrunn ditt valg. 26. Fettvevsmetabolismen er gjenstand for metabolsk regulering. A. Når blodkonsentrasjonen av insulin øker vil dette medføre at: i. Lipolysen i fettvev øker i aktivitet fordi den hormonsensitive lipasen stimuleres, samtidig som lipidsyntesen stimuleres. ii. Lipolysen i fettvev får nedsatt aktivitet, mens lipidsyntesen stimuleres. iii. Lipolysen i fettvev stimuleres, mens lipidsyntesen hemmes. Svar: (ii) er riktig, Insuling er antilipolytisk og vil potent hemme den hormonsensitive lipasen. Samtidig stimuleres lipidsyntese pga økt blodglukose som gir økt glukoseopptak i fettvevet, og påfølgende tilgang på glyserol-3-fosfat. B. Fettvevsmetabolismen er indirekte regulert via blodglukosekonsentrasjonen. Hovedårsaken til dette er at: i. Fettvevscellene er helt avhengige av glykolysen til dekning av eget energibehov. ii. Fettvevscellene kan bare anvende blodglukose til syntese av glyserol-3-fosfat. iii. Nedsatt blodglukosekonsentrasjon stimulerer lipidsyntesen i fettvevet. Svar (ii) er riktig. Fettvevsceller kan bare lage glyserol-3-fosfat fra glukose, via en fosforylert glykolytisk intermediær (di-hydroksy-acetonfosfat). Cellene kan ikke fosforylere glyserol direkte fordi de ikke har glyserokinase aktivitet (ulikt for eks. leverceller). C. Når blodkonsentrasjonen av adrenalin øker vil dette i fettvevet medføre at: -11-

12 i. Den hormonsensitive lipasen blir defosforylert og hemmet, og at lipidsyntesen stimuleres. ii. Den hormonsensitive lipasen fosforyleres og aktiveres, og at lipolysen stimuleres. iii. Både fettvevscellenes glukoseopptak, og lipidsyntese, blir stimulert. Svar: (ii) er riktig. Adrenalinpåvirking av fettvevscellene gir økt nivå av intracellulært samp. Dette gir stimulering av samp avhengig proteinkinase, som så fosforylerer, og aktiverer, den hormonsensitive lipasen. Lipolysen stimuleres. 27. Leverens glykogenmetabolisme er gjenstand for presis metabolsk regulering. A. Ett av glykogenmetabolismens regulerte enzymer er glykogensyntase. i. Enzymet overfører glukose fra UDPglukose til en ikkereduserende ende av en voksende glykogenkjede. ii. Dette enzymet danner 1,6 forgreningspunkter på glykogenmolekylet. ii. Enzymet er bare aktivt i fosforylert form. Svar: (i) er riktig. Enzymet er ansvarlig for syntesen av hovedkjedene i glykogen, og dette innebærer dannelse av a 1.4-glykosidebindingen mellom C-atom nr. 1 innkommende glukosemolekyl (fra UDPglukose) til en ikke-reduserende ende (C-atom nr. 4 i glukose) av en eksisternede glykogenkjede. B. Når blodkonsentrasjonen av glukagon øker vil: i. Leverens glykogensyntase defosforyleres og blir aktivert. ii. Leverens amylo-1,6-glukosidase blir fosforylert og hemmet. iii. Leverens glygogenfosforylase fosforyleres og aktiveres. Svar: (iii) er riktig. Når glukagon bindes til hepatocyttene gir dette økt intracellulær samp, og medfølgende stimulering av samp-avhengig proteinkinase aktivitet. Dette vil videre resultere i stimulering av glykogen fosforylase kinase som i sin tur fosforylerer, og aktiverer, glykogenfosforylase. C. Du har fastet i 3 dager. To av de følgende tre parametere vil da vise økte verdier. Angi den parameteren som ikke øker, og begrunn svaret ditt. i. Konsentrasjonen av glyserol-3-fosfat i fettvevsceller. ii. Proteolyse i skjelettmuskel iii. Blodkonsentrasjonen av 3-hydroksybutyrat. Svar: (i) er riktig. Faste, nedsatt blodglukose, lite insulin. Fettvevscellene tar ikke opp glukose fra blodbanen (insulinavhengig opptak). Lav glykolyse i fettvevscellene, lite di-hydroksy-aceton-fosfat, og derfor nedsatt konsentrasjon av glyserol-3-fosfat. 28. Enzymer som regulerer intermediær metabolisme katalyserer ofte termodynamisk koblede reaksjoner. som skissert: A B G o = + 9.6kJ/mol B C G o = -44.7kJ/mol Nettoreaksjon: A C A. Begrunn hvilket av de følgende svaralternativer som er korrekt hva angår -12-

13 nettoreaksjonen A C: i. Keq er << 1 ii. Reaksjonen vil gå spontant fra A C iii. Reaksjonen er endergon. Svar: (ii) er riktig Netto G o blir stor og negativ [(+9,6 +(-44.7))=-35.1kJ/mol]. Reaksjonen er derfor spontan fra A C. B. I leveren unngås en hensiktsløsog energisløsende syklus mellom glukose nedbrytning og resyntese fordi: i. Glykolysen og glukoneogenesen ikke bruker noen felles enzymer. ii. Levercellens konsentrasjon av substratet, glukose, reguleres via iii. blodglukosekonsentrasjonen. Nøkkelpunkter i glykolyse og glukoneogenese bruker forskjellige enzymer for glykolyse og glukoneogenese. Svar: (iii) er riktig. På nøkkelpunktene foreligger det separate enzyme for glykolyse og glukoneogenese; hekso(gluko)kinase/glukose-6-fosfatase, fosfofruktokinase/fruktose-1,6-bisfosfatase, pyruvat kinase/ pyruvat karboksylase+fosfoenolpyruvatkarboksykinase. -13-