ProSpecT TM shigatoksin E. coli (STEC) mikroplateanalyse

Transkript

1 ProSpecT TM shigatoksin E. coli (STEC) mikroplateanalyse R tester R tester 1 BRUKSOMRÅDE ProSpecT shigatoksin E. coli (STEC) mikroplateanalyse er beregnet på kvalitativ påvisning av shigatoksiner (Stx1 og Stx2) i vannholdige ekstrakter fra fecesprøver og buljonganrikede feceskulturer. Testen er beregnet på bruk som et hjelpemiddel i diagnostiseringen av enterohemorragisk E. coli-infeksjoner. 2 SAMMENDRAG Shigatoksinproduserende E. coli (STEC) er anerkjent som viktige etiologiske faktorer ved diaré og ved alvorlige utbrudd og sporadiske tilfeller med livstruende hemorragisk kolitt og hemolytisk uremisk syndrom (HUS 2,3,13,14 ). Stammer av E. coli som produserer disse effektene ble først beskrevet av Konowalchuk et al. som identifiserte et cytotoksin som var cytopatisk for veroceller og ble omtalt som verotoksin, VT 6,7,8. Cytotoksinet ble påvist å være nært beslektet med shigatoksinet av O Brien et al. 9 som omtalte toksinet som et shigalignende toksin (SLT). To former av toksinet har blitt identifisert, Stx1 og Stx2 9 og shigatoksinproduserende E. coli (STEC)-isolater er påvist å produsere én eller begge cytotoksiner 15,16. E. coli O157:H7 er den oftest identifiserte EHEC-serotypen og kan isoleres og identifiseres ved de fleste kliniske laboratorier 1,10,12,14. Minst 50 seroptyper av E. coli har imidlertid blitt tilknyttet produksjonen av cytotoksiner og utviklingen av HUS og/eller hemorragisk kolitt 5,11. Karmali 4 beskrev en cytotoksinanalyse for toksinpåvisning, men analysen krever betraktelig tid og ekspertise for å bekrefte forekomsten av cytotoksin. ProSpecT shigatoksin E. coli (STEC) mikroanalyse er en enzymimmunanalyse som muliggjør direkte påvisning av Stx1- og Stx2-toksiner i avføringsprøver eller i buljonganrikede feceskulturer. 3 PRINSIPPET FOR TESTEN ProSpecT shigatoksin E. coli (STEC) mikroplateanalyse er en fastfasteimmunanalyse for påvisning av shigatoksiner. Fortynnede avføringsprøver tilsettes i avbrekkbare mikroplatebrønner som polyklonalt antistoff fra kanin mot shigatoksin 1 og 2 er bundet til. Hvis toksin er tilstede, fanges det av det bundne antistoffet. Brønnene inkuberes og vaskes deretter for å fjerne ubundet materiale. Enzymkonjugatet (monoklonalt antistoff mot shigatoksin 1 og 2 fra mus merket med pepperrotperoksidaseenzym) tilsettes. Brønnene inkuberes og vaskes deretter for å fjerne ubundet enzymkonjugat. I en positiv reaksjon, binder toksin enzymkonjugatet til brønnen. Substratet for enzymet, 3,3,5,5 - tetrametylbenzidin (TMB), tilsettes. I en positiv reaksjon, konverterer enzymet som er bundet til brønnen av toksin substratet til et farget reaksjonsprodukt. Fargeutvikling kan påvises visuelt eller spektrofotometrisk. I en negativ reaksjon, er det ikke noe toksin eller et utilstrekkelig nivå av toksin til stede til å binde enzymkonjugatet, og det utvikles ikke noe farget reaksjonsprodukt. 4 SYMBOLDEFINISJONER Katalognummer In vitro-diagnostisk medisinsk utstyr Innholder tilstrekkelig til <n> tester Se bruksanvisningen Temperaturbegrensning (oppbevaringstemp.) Batchkode (lotnummer) Brukes innen (utløpsdato) Produsent Fortynnet prøve NO 5 INNHOLD I SETTET, KLARGJØRING FOR BRUK OG OPPBEVARING ProSpecT shigatoksin E. coli (STEC) mikroplateanalyse inkluderer nok reagenser til å utføre 48 eller 96 tester. Se også Forholdsregler, avsnitt 6. Utløpsdatoen for hvert sett er angitt på etiketten. Oppbevar alle komponenter ved 2 til 8 C. Før bruk skal alle reagenser ha romtemperatur (20-25 C) og blandes forsiktig. Sett de ubrukte reagensene i kjøleskapet etter bruk. Alle reagenser unntatt vaskebufferen leveres blandet til bruksstyrke. Reagenser kan dispenseres rett fra dråpeflaskene eller helles ut for bruk med flerkanalpipetter. Hvis det helles for mye reagens, skal det overflødige kastes. Overflødig reagens må ikke helles tilbake i flasken. Bruksanvisning Overføringspipetter Holder og deksel for mikroplaterad Prosedyrekort Mikroplate* (8 brønner / rad) 6 rader (R ) eller 12 rader (R ) belagt med polyklonalt antistoff fra kanin mot shigatoksin 1 og 2. Ubrukte mikroplaterader skal oppbevares i folieposen som inneholder tørkemiddel for å stenge ute fukt. Enzymkonjugat* Én dråpeflaske om inneholder 12 ml (R ) eller 25 ml (R ) pepperrotperoksidasemerket monoklonalt antistoff fra mus mot shigatoksin 1 og 2 med antimikrobielle stoffer. Positiv kontroll Én dråpeflaske som inneholder 4 ml E. coli kultursupernatant som inneholder shigatoksin 1 og 2 med bovint fosterserum, kaninserum og antimikrobielle stoffer. Negativ kontroll Én dråpeflaske som inneholder 4 ml av en bufret løsning med kaninserum, rødt fargestoff og antimikrobielle stoffer. Bakteriell prøvefortynner Én flaske som inneholder 120 ml av en bufret løsning med kaninserum, rødt fargestoff og antimikrobielle stoffer. Vaskebuffer Én flaske som inneholder 120 ml (x10) konsentrert bufret løsning med antimikrobielle stoffer. Fortynn (10x) vaskebufferkonsentrat til (xl) ved å tilsette 1 del konsentrat til 9 deler destillert eller deionisert vann. Fortynnet vaskebuffer er stabil i 1 måned når den oppbevares ved 2-8 C. Fargesubstrat Én dråpeflaske som inneholder 12 ml (R ) eller 25 ml (R ) 3,3,5,5 - tetrametylbenzidin (TMB) i buffer. Fargesubstratet skal oppbevares i og brukes fra den lysbeskyttede flasken som det leveres i. Hvis en alikvot av en eller annen grunn fjernes fra originalflasken, skal ikke det ubrukte fargesubstratet returneres til originalflasken. Stoppløsning Én dråpeflaske som inneholder 12 ml 0,46 mol/l svovelsyre. *Merk: Bytt ikke ut reagenser med reagenser med andre lotnumre. 6 FORHOLDSREGLER 1 Reagensene er kun til in vitro-diagnostisk bruk.

2 Kun til yrkesbruk. Vennligst se databladet for materialsikkerhet (MSDS) og produktmerkingen for informasjon om potensielt farlige komponenter. HELSE- OG SIKKERHETSINFORMASJON 6.1 Reagenser tilberedes fra biologisk materiale og skal håndteres som potensielt smittefarlig materiale. Kasseres ved bruk av egnede prosedyrer for biologisk farlig avfall. 6.2 Ikke pipetter med munnen. Bruk engangshansker og vernebriller når prøvene håndteres og analysen utføres. Vask hendene grundig når du er ferdig. 6.3 Prøver kan inneholde potensielt smittefarlige stoffer og skal håndteres ved biosikkerhetsnivå 2 som anbefalt i CDC/NIHhåndboken, Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories, 5. utgave. 6.4 Vaskebuffer inneholder potensielt hudsensibiliserende stoff (< 1 % v/v). Unngå hudkontakt. Bruk vinyl- eller nitrilhansker til engangsbruk. 6.5 Kasser brukt vaskebuffer i egnede beholdere for biologisk farlig avfall. ANALYTISKE FORHOLDSREGLER 6.6 Les og følg alle instruksjonene i denne bruksanvisningen. 6.7 Reagensene leveres ved de nødvendige bruksstyrkene, med unntak av vaskebufferkonsentratet. Ikke fortynn reagenser, bortsett fra når det er anvist. 6.8 Ikke bruk reagensene etter utløpsdatoene. Utløpsdatoene er trykt på hver reagensetikett. Dersom reagenser brukes etter utløpsdatoen kan det påvirke nøyaktigheten av resultatene. 6.9 Følgende vanlige reagenser kan brukes på tvers av ProSpecTproduktutvalget: vaskebuffer, fargesubstrat og stoppløsning Mikrobiell kontaminasjon av reagenser kan redusere nøyaktigheten av analysen. Unngå mikrobiell kontaminasjon av reagensene ved å bruke sterile engangspipetter når alikvoter fjernes fra reagensflasker La alle reagenser og prøver nå romtemperatur (20-25 C) før bruk Mikroplaterader må oppbevares i de forseglbare folieposene, med tørkemiddel, for å beskytte mikroplatebrønnene mot fukt Avføringsprøver må blandes grundig før prøvebehandling for å sørge for nøyaktig representasjon av prøven. IKKE KONSENTRER PRØVER FØR TESTING Fargesubstrat er følsomt overfor lyseksponering. Hvis reagensen eksponeres for lys og utvikler farge, må reagensen kasseres Personer som er fargeblinde eller har nedsatt syn vil kanskje ikke kunne lese testen og må bruke spektrofotometriske avlesninger for å tolke resultater Tilsett reagenser i testbrønnene i samme rekkefølge gjennom prosedyren. Kontaminasjon unngås ved å ikke berøre væsken i brønnene med flaskemunningene Ta tiden på hver inkubasjon nøyaktig. Start tidtakingen når reagensen er tilsatt i den siste brønnen på hver mikroplate som skal testes. Nøyaktig tidtaking sikres ved å behandle maksimalt tre plater med 96 brønner på én gang. Avvik fra den fastsatte prosedyren kan endre analysens utførelse Det er viktig at dråpeflaskene holdes vertikalt og at dråpen dannes ved flaskemunningen. Hvis flaskemunningen blir våt, vil en dråpe med feil volum dannes rundt enden i stedet for ved spissen; Hvis dette skjer, må munningen tørkes før du fortsetter Shigatoksin 1 og toksinet som produseres av Shigella dysenteriae-stammer av type 1 (shigatoksin) er nesten identiske. ProSpecT shigatoksin E. coli (STEC) mikroplateanalyse er derfor positiv når en påvisbar mengde shigatoksin er tilstede i prøven. 7 INNSAMLING AV FECESPRØVER Optimale resultater ved direkte testing av avføringsprøver oppnås hvis prøvene testes umiddelbart når de mottas i laboratoriet. Hvis testing kan gjennomføres innen 48 timer fra prøvetaking av ferske prøver eller innen 7 dager for prøver i Cary Blair-transportmedia, kan prøver oppbevares ved 2-8 C, ellers må de oppbevares ved -20 C eller lavere. FERSK Ukonserverte prøver (eller prøver i Cary Blair-transportmedia) skal oppbevares ved 2-8 C eller nedfryst ved -20 C eller lavere rett etter prøvetaking. Prøver til dyrking skal legges i buljongen innen én eller to timer etter mottak i laboratoriet. 2 Prøver fortynnet i bakteriell prøvefortynning kan oppbevares ved 2-8 C i opptil 48 timer før testing. NEDFRYST Hvis dyrking ikke kan utføres innen 1-2 timer, skal ferske eller Cary Blair-konserverte prøver til dyrking fryses ved -20 C eller lavere. Gjentatt frysing/tining kan føre til at toksinet degraderes. 8 TESTPROSEDYRE NØDVENDIG MATERIALE SOM FØLGER MED Se Innhold i settet, avsnitt 5 NØDVENDIG MATERIALE SOM IKKE MEDFØLGER Beholder for innsamling av avføringsprøver Tidtaker som måler minutter Vaskeflaske for vaskebuffer Destillert eller deionisert vann VALGFRITT MATERIALE SOM IKKE FØLGER MED Mikroplateleser som kan lese 450 nm eller 450/620 til 650 nm Applikatorpinner med bomulls- eller rayonspiss Mikropipette til levering av volum opptil 200 µl Prøverør til engangsbruk av plast eller glass Vorteksblander med plateadapter eller rister PROSEDYRE 8.1 Prøveklargjøring for analyse: Prøver i Cary Blairtransportmedium kan tilsettes direkte i mikroplatebrønner for testing (se trinn 8.4 nedenfor). Sørg for å blande prøvene i transportmedium før de overføres til mikroplatebrønnen. Ferske avføringsprøver eller buljonganrikede kulterer må fortynnes (se boks A eller B nedenfor). A Direkte avføringstest 1 Tilsett 0,6 ml bakteriell prøvefortynningsvæske i et rent 12 x 75 mm rør. 2 Bland avføringen så grundig som mulig og fortynn som følger: a Flytende eller halvfast avføring: tilsett 0,3 ml (tredje merke fra den vedlagte pipettespissen) ved bruk av en overføringspipette. Bland avføringen grundig inn i den bakterielle prøvefortynningsvæsken og la overføringspipetten bli værende i røret. b. Fast avføring: tilsett 0,3 gm (ca. 6 mm diameter) ved bruk av en applikatorpinne. Løs opp avføringen i den bakterielle prøvefortynningsvæsken og sett en overføringspipette i røret. c. Avføringsprøver i Cary Blair-transportmedia skal tilsettes direkte i mikroplatebrønnen uten ytterligere fortynning. d. Vend fecesoppløsningen. 3 FORTSETT TIL TRINN 8.2 B Buljongmetode 1 Inokuler 50 µl eller 50 µg (på størrelse med en liten ert) fersk avføring eller avføring i Cary Blair-transportmedia i 5 ml tryptisk soyabuljong (TSB), modifisert tryptisk soyabuljong (mtsb) eller MacConkey-buljong. 2 Inkuber ved 37 C for timer. 3 Tilsett 0,6 ml bakteriell prøvefortynningsvæske i et rent 12 x 75 mm rør. 4 Overfør 0,3 ml buljongkultur inn i 0,6 ml bakteriell prøvefortynningsvæske med en overføringspipette. La overføringspipetten bli værende i røret. 5 FORTSETT TIL TRINN Åpne folieposen, fjern det ønskede antall mikroplaterader og plasser i en holder for mikroplaterader. Bruk én brønn for den negative kontrollen og én brønn for den positive kontrollen. Hvis du bruker mindre enn 8 brønner, bryter du løs ønsket antall brønner fra raden og legger ubrukte brønner tilbake i folieposen med tørkemiddel. FORSEGLE POSEN GODT FOR Å STENGE UTE FUKT OG SETT DEN TILBAKE I KJØLESKAPET. 8.3 Tilsett 4 dråper (200 µl) negativ kontroll i brønn A1. Tilsett 4 dråper (200 µl) positiv kontroll i brønn B Tilsett 4 dråper (200 µl) fortynnet prøve eller ufortynnet avføring i Cary Blair-transportmedia per brønn med en overføringspipette. Merk: Plasser overføringspipettens åpning rett innenfor brønnene for å unngå sprut i tilstøtende brønner.

3 8.5 Dekk mikroplaten og inkuber ved romtemperatur (20-25 C) i 60 minutter. Start tidtakingen når den siste prøven er tilsatt. 8.6 Rist ut eller aspirer innholdet i brønnene. Vask ved å fylle hver brønn fullstendig med fortynnet vaskebuffer (~ µl/brønn). Rist ut eller aspirer all væske fra brønnene etter hver vask. Vask 3 ganger totalt. Etter siste vask skal du fjerne innholdet og dunke platen mot rene papirhåndklær eller aspirere. Fjern så mye vaskebuffer som mulig, men ikke la brønnene tørke ut på noe tidspunkt. 8.7 Tilsett 4 dråper (200 µl) enzymkonjugat i hver brønn. 8.8 Dekk mikroplaten og inkuber ved romtemperatur (20-25 C) i 30 minutter. 8.9 Rist ut eller aspirer og vask hver brønn 5 ganger som i trinn Tilsett 4 dråper (200 µl) fargesubstrat i hver brønn Dekk mikroplaten og inkuber ved romtemperatur (20-25 C) i 10 minutter Tilsett 1 dråpe (50 µl) stoppløsning i hver brønn. Bank eller vend brønnene til gulfargen er jevnt fordelt. Les av reaksjonene innen 10 minutter etter at stoppløsningen er tilsatt Les av visuelt eller spektrofotometrisk ved 450 nm (enkel bølgelengde) eller 450/620 til 650 nm (dobbel bølgelengde). 9 KVALITETSKONTROLL Positive og negative kontroller må inkluderes hver gang testen utføres. De positive og negative kontrollene fungerer som både reagens- og prosedyrekontroller. Hensikten med kontrollene er å kontrollere og avsløre eventuelle vesentlige feil i reagensene. Den positive kontrollen sikrer ikke presisjon ved analysens cut-off. Den optiske tettheten (O.T.) til den negative kontrollen skal være < 0,100 ved 450 nm eller < 0,070 ved 450/620 til 650 nm. Den negative kontrollen skal være fargeløs når den leses visuelt. Hvis gulfarge tilsvarende 1+ eller høyere på prosedyrekortet er til stede i den negative kontrollen, skal testen gjentas med særlig oppmerksomhet på vaskeprosedyren. O.T. for den positive kontrollen skal være > 0,500 ved 450 nm eller 450/ 620 til 650 nm, og skal være lik eller høyere enn 2+ reaksjon når den leses visuelt. Hvis gulfargen i den positive kontrollen er mindre enn 2+ på prosedyrekortet, må du oppsøke teknisk støtte. 10 RESULTATER Se det vedlagte prosedyrekortet for fargetolkninger. VISUELT 10.1 Les testresultatene ved å sammenligne med reaksjonsfargene på prosedyrekortet. Positiv: gulfarge med minst 1+ intensitet. Negativ: fargeløs. Ubestemmelig: svak gulfarge, mindre enn 1+ reaksjon Tolkning av visuelle resultater: Positiv: Hvis en gulfarge på minst 1+ intensitet utvikles i prøvebrønnen, inneholder prøven enten Stx1 eller Stx2 eller begge og testen er positiv. Negativ: En fargeløs reaksjon er et negativt testresultat og angir at ingen Stx1 eller Stx2 eller et upåviselig nivå av toksiner er til stede i den testede prøven. Ubestemmelig: Hvis en svak gulfarge på mindre enn 1+ reaksjon utvikles, er testen ubestemmelig. Ubestemmelige resultater skal gjentas. Hvis de gjentatte testresultatene er positive, er prøven positiv. Hvis de gjentatte testresultatene er negative, er prøven negativ. Hvis resultatene fra de gjentatte testene fremdeles er ubestemmelige, skal en annen prøve tas og testes. SPEKTROFOTOMETRISK 10.3 Les resultater ved enten enkel (450 nm) eller dobbel (450/620 til 650 nm) bølgelengde Les testresultatene: A. Enkel bølgelengde Positiv: O.T. > 0,150 Negativ: O.T. < 0,100 Ubestemmelig: O.T. 0,100-0,150. B. Dobbel bølgelengde Positiv: O.T. > 0,100 Negativ: O.T. < 0,070 Ubestemmelig: O.T. 0,070-0, Tolkning av spektrofotometriske resultater: Positiv: En O.T.-avlesning på mer enn 0,150 (enkel bølgelengde) eller mer enn 0,100 (dobbel bølgelengde) er positiv og angir forekomst av Stx1 og/eller Stx2. Negativ: En O.T.-avlesning på mindre enn 0,100 (enkel bølgelengde) eller mindre enn 0,070 (dobbel bølgelengde) er et negativt resultat og angir at det ikke finnes Stx1 eller Stx2 eller begge, eller at et upåviselig nivå av toksinet finnes i den testede prøven. Ubestemmelig: O.T.-avlesninger på 0,100-0,150 (enkel bølgelengde) eller 0,070-0,100 (dobbel bølgelengde) er ubestemmelige. Ubestemmelige resultater skal gjentas. Hvis de gjentatte testresultatene er positive, er prøven positiv. Hvis de gjentatte testresultatene er negative, er prøven negativ. Hvis resultatene fra de gjentatte testene fremdeles er ubestemmelige, skal en annen prøve tas og testes. Merk: Brønner som er klare visuelt men gir en O.T.-avlesning som ikke stemmer overens med den visuelle tolkningen, skal anses som avvikende avlesninger og inspiseres for bobler, små partikler i brønnene eller en ugjennomsiktig hinne på bunnen av brønnen. Hinnen fjernes ved å tørke undersiden av brønnene og lese av O.T. på nytt. Hvis uoverensstemmelsen mellom de visuelle og O.T.-avlesningene vedvarer, må testen gjentas. 11 UTFØRELSESGRENSER Validiteten for resultatene med ProSpecT shigatoksin E. coli (STEC) mikroplateanalyse avhenger av at kontrollreaksjonen fungerer som ventet. Se Kvalitetskontroll, avsnitt 9. Et negativt testresultat utelukker ikke muligheten for at det finnes shigatoksiner, og kan inntreffe når antigennivået i prøven er under testens påvisningsnivå. Det er ikke påvist noen sammenheng mellom mengden antigen i prøven og klinisk presentasjon. Som med alle IN VITRO-diagnostiske tester, skal resultater tolkes av klinikeren i sammenheng med kliniske funn og/eller andre laboratorieresultater. Riktig prøvetaking og -behandling er avgjørende for optimal utførelse av analysen. Optimale testresultater oppnås når prøver testes så snart som mulig etter prøvetakingen. Se Innsamling av fecesprøver, avsnitt 7. ProSpecT shigatoksin E. coli (STEC) mikroplateanalyse har blitt klassifisert som høy kompleksitet. 12 FORVENTEDE VERDIER Minst 50 ulike serotyper av shigatoksinproduserende E. coli (STEC) har blitt tilknyttet produksjonen av cytotoksiner og utviklingen av livstruende hemorragisk kolitt og hemolytisk uremisk syndrom (HUS) - en omfattende komplikasjon som fører til nyresvikt, trombocytopeni og anemi. Selv om unge barn har høy risiko for å utvikle HUS som en følge av å rammes av shigatoksinproduserende E. coli-infeksjon, kan andre utvalgte underpopulasjoner også ha risiko for STEC-infeksjon, f.eks. eldre og personer med nedsatt immunforsvar. Som observert i resultatene fra de kliniske studiene med ProSpecT shigatoksin E. coli (STEC) mikroplateanalyse, var en rekke ulike serotyper tilstede i den testede populasjonen. Testing for STECinfeksjoner skal ikke begrenses til tester som kun er spesifikke for O157:H7. Det skal også bemerkes at det ikke alltid er en direkte sammenheng mellom resultatene fra direkte og buljonganriket testing. Dette kan blant annet skyldes følgende: a.) toksin er tilstede i avføringen ved et påviselig nivå, men STEC-celler er ikke lenger levedyktige for dyrking; b.) isolerte E. coli O157-stammer fra avføringskultur fra pasienter er omvendt tilknyttet intervallet mellom starten av diaré og den mikrobiologiske kulturen 17 ; c.) toksin kan være tilstede i avføringen ved et nivå som er upåviselig med analysen, men STEC-celler er fremdeles levedyktige for dyrking; og d.) antimikrobiell behandling kan påvirke dyrkbarheten til STEC-celler. 13 UTFØRELSESEGENSKAPER SENSITIVITET OG SPESIFISITET ProSpecT shigatoksin E. coli (STEC) mikroplateanalyse ble evaluert ved tre geografisk atskilte klinikker i USA, Canada og Tyskland. Klinikkene var et storbysykehus i Virginia, USA, et barnesykehus i Toronto, Canada og en stor mikrobiologisk institusjon i Tyskland. Pasientpopulasjoner representert i prøvepoolen var symptomatiske pasienter i voksne og pediatriske populasjoner med normal prevalens. Prøver ble levert ukonservert og ble testet i ProSpecT shigatoksin E. coli (STEC) mikroplateanalyse som ferske prøver og som anrikede

4 kulturer over natten. Alle prøver ble også testet med en cytotoksinanalyse (CTA) for forekomst av shigatoksiner. Shigatoksinpositive prøver ble isolert og serotypet (se tabell 3). En polymerasekjedereaksjon (PCR)- amplikasjonsanalyse kun til forskningsbruk for forekomst av shigatoksingenet ble utført på alle positive og avvikende resultater. Resultatene ved hvert teststed presenteres i tabell 1 og 2. I den direkte testmetoden var det 20 positive prøver (EIA+, CTA+, PCR+). Det var 3 EIA-, CTA+, PCR+ prøver. Det var 5 EIA+, CTA-, PCR- prøver. Alle ubestemmelige resulater ble avklart som sanne negative. 354 prøver var negative med begge metoder (EIA-, CTA-). Den totale innledende og avklarte utførelsen av ProSpecT shigatoksin E. coli (STEC) mikroplateanalyse presenteres nedenfor i tabell 1. Tabell 1. ProSpecT shigatoksin E. coli (STEC) mikroplateanalyse sammenlignet med en cytotoksinanalyse av direkte avføringsprøver. Direkte prøvetesting Innledende resultater Avklarte resultater* Studiested Ubst. + - Ubst Ubst Ubst Totale prøver: Sensitivitet: 92,3 % 92,3 % Spesifisitet: 98,7 % 98,7 % Studiested Ubst. + - Ubst Ubst Ubst Totale prøver: Sensitivitet: 80,0 % 80,0 % Spesifisitet: 98,4% 98,5 % Kombinert + - Ubst. + - Ubst Ubst Ubst Totale prøver: Sensitivitet: 87,0 % (66,4-97,2) 87,0 % (66,4-97,2) Spesifisitet: 98,6 % (96,7-99,5) 98,6 % (96,6-99,5) Korrelasjon: 95,0 % (92,3-97,0) 97,9 % (95,9-99,1) Tallene i parentes er 95 % konfidensintervaller. *De avklarte tabellene viser resultatene fra gjentatt EIA-testing på prøvene som var ubestemmelige innledningsvis. Som vist i tabell 1 er det 97,9 % samsvar i den direkte prøvetestingsmetoden for de avklarte data mellom ProSpecT shigatoksin E. coli (STEC) mikroplateanalyse og cytotoksinanalyse når resultatene fra begge stedene kombineres. I den buljonganrikede dyrkingsmetoden var det 63 positive prøver (EIA+, CTA+, PCR+). Det var 3 EIA-, CTA+, PCR- prøver. Ved gjentatt CTAtesting ble 2 av 3 avklart som sanne negative. Det var 10 EIA+, CTA-, PCR- prøver. Alle ubestemmelige resulater ble avklart som sanne negative etter gjentatt testing. 771 prøver var negative med begge metoder (EIA-, CTA-). Den totale innledende og avklarte utførelsen av ProSpecT shigatoksin E. coli (STEC) mikroplateanalyse presenteres i tabell 2. Tabell 2. ProSpecT shigatoksin E. coli (STEC) mikroplateanalyse sammenlignet med en cytotoksinanalyse av buljonganrikede kulturprøver. Buljonganrikede kulturer Innledende resultater Avklarte resultater* Studiested Ubst. + - Ubst Totale prøver: Sensitivitet: 100 % 100 % Spesifisitet: 99,4 % 99,4 % 4 Studiested Ubst. + - Ubst Totale prøver: Sensitivitet: 90,0 % 90,0 % Spesifisitet: 100 % 100 % Studiested Ubst. + - Ubst ** Totale prøver: Sensitivitet: 95,5 % 100 % Spesifisitet: 97,9 % 97,9 % Kombinert + - Ubst. + - Ubst Totale prøver: Sensitivitet: 95,5 % (87,3-99,1) 98,4 % (91,6-100) Spesifisitet: 98,7 % (97,6-99,4) 98,7 % (97,7-99,4) Korrelasjon: 97,6 % (96,4-98,5) 98,7 % (97,7-99,3) Numrene i parentes er 95 % konfidensintervaller. * De avklarte tabellene viser resultatene fra gjentatt EIA-testing på prøvene som var ubestemmelige innledningsvis. ** Merk at ved studiested 3 ble 2 innledningsvis CTA-falske resultater negative ved gjentatt CTA-testing. Som vist i tabell 2 var det 98,7 % samsvar i den buljonganrikede dyrkingsmetoden for de avklarte data mellom ProSpecT shigatoksin E. coli (STEC) mikroplateanalyse og cytotoksinanalyse når resultatene fra alle stedene ble kombinert. Ulike serotyper av shigatoksinproduserende E. coli-stammer er testet med ProSpecT shigatoksin E. coli (STEC) mikroplateanalyse og påvist reaktive enten fra direkte avføringstesting eller fra anriket buljong. Nedenfor er en liste over de testede serotypene, antallet serotypespesifikke prøver og typen toksin som produseres av hver stamme, hvis kjent. Tabell 3. Antallet ulike seroptyper av shigatoksinproduserende E. coli-stammer isolert fra positive prøver. Serotype Antallet isolerte stammer Serotyper Stx1 Stx2 Stx1/2 Stx2c Ukjent Total O8:H9 1 1 O26:H O O88:H5 1 1 O O103:H2 1 1 O111:NM O O O O153:H O157:H O Totale toksintyper Tabell 4. Shigatoksinpositive tester etter avføringskonsistens Avføringskonsistens Vannaktig Myk Slimete Vannaktig/ Myk/ Blodig slimete slimete Ant. fecesprøver Shigatoksin Cytotoksin ANALYTISK SENSITIVITET ProSpecT shigatoksin E. coli (STEC) mikroplateanalyse påviser ca. 52 pg/ml Stx1 og 126 pg/ml Stx2.

5 REPRODUSERBARHET Variasjonskoeffisienten (CV) mellom analyser eller mellom serier for ProSpecT shigatoksin E. coli (STEC) mikroplateanalyse ble evaluert ved å velge én negativ og tre positive prøver med varierende avlesninger for optisk tetthet. Hver prøve ble testet i 24 brønner per kjøring i tre etterfølgende kjøringer. Gjennomsnittlig CV mellom analyser var 8,69 %. Prøve Gj.sn. O.T. Standardavvik % CV 1 0,065 0, ,61 % 2 0,264 0,0176 6,67 % 3 0,675 0,0270 4,00 % 4 0,830 0,0703 8,48 % Variasjonskoeffisienten innen analyse eller innen serie ble evaluert ved å teste 24 brønner med hver av de 4 prøvene. Gjennomsnittlig CV innen analyse var 4,59 %. Prøve Gj.sn. O.T. Standardavvik % CV 1 0,069 0,0055 8,01 % 2 0,274 0,0134 4,90 % 3 0,563 0,1490 2,65 % 4 1,226 0,0340 2,78 % KRYSSREAKTIVITET Det oppsto ingen kryssreaksjon når flere forskjellige organismer fra human kolonmikroflora ble testet i ProSpecT shigatoksin E. coli (STEC) mikroplateanalyse. Tester ble gjennomført ved å så organismene oppført nedenfor inn i shigatoksinnegative og -positive fecesprøver. Bakterier ble utsådd ved konsentrasjoner på > 1 x 10 7 CFU/ml avføring. Ikkeshigatoksinproduserende patogene E. coli-stammer (EPEC, ETEC, EIEC) ble også testet i ProSpecT-analysen, og var negative. Campylobacter jejuni ATCC Citrobacter braakii ATCC Enterobacter cloacae ATCC Escherichia coli ATCC Escherichia coli, EIEC, ATCC (O124:NM) Escherichia coli, EPEC, ATCC (O55:NM) Escherichia coli, EPEC, ATCC (O111:NM) Escherichia coli, ETEC/EPEC, ATCC (O111:NM) Escherichia coli, VT negative, ATCC Enterococcus faecalis ATCC Klebsiella pneumoniae ATCC Proteus vulgarus, ATCC Pseudomonas aeruginosa ATCC Salmonella typhimurium, SA Serratia liquefacians ATCC Shigella dysenteriae ATCC Shigella flexneri ATCC Shigella sonnei, ATCC Staphylococcus aureus ATCC Yersinia enterocolitica ATCC BIBLIOGRAFI 1. Johnson, W.M., H. Lior, and G.S. Bezanson, Cytotoxic Escherichia coli O157:H7 Associated with Haemorrhagic Colitis in Canada. Lancet pp Karmali, M.A., B.T. Steele, M. Petric, and C. Lim, Sporadic Cases of Haemolytic Uraemic Syndrome Associated with Faecal Cytotoxin and Cytotoxin-Producing Escherichia coli. Lancet pp Karmali, M.A., M. Petric, C. Lim, P.C. Fleming, G.S. Arbus, and H. Lior, The Association Between Haemolytic Uraemic Syndrome and Infection by Verotoxin-Producing Escherichia coli. J. Infect. Dis. 151(5): Karmali, M.B., Laboratory Diagnosis of Verotoxin-Producing Escherichia coli Infections. Clin. Microbiol. Newsletter. 9(9): Kleanthous, H., H.R. Smith, S. M. Scotland, R.J. Gross, B. Rowe, C. M. Taylor, and D.V. Milford Haemolytic uraemic syndrome in the British Isles, : association with Verocytotoxin producing Escherichia coli. Part 2. Microbiological aspects. Am. J. Dis. Child. 65: Konowalchuk, J., I. Speirs, and S. Stavric Vero Response to a Cytotoxin of Escherichia coli. Infect. Immun. 18(3): Konowalchuk, J., N. Dickie, S. Stavric, and J.I. Speirs. 1978, Properties of an Escherichia coli Cytotoxin. Infect. Immun. 20: Konowalchuk, J., N. Dickie, S. Stavric, and J.I. Speirs, Comparative Studies of Five Heat-labile Toxic Products of Escherichia coli. Infect. Immun. 22: O Brien, A.D., G.D. LaVeck, M.R. Thompson, and S.B. Formal, Production of Shigella dysenteriae type 1-like Cytotoxin by Escherichia coli. J. Infect. Dis. 144(6): O Brien, A.D., T.A. Lively, M.E. Chen, S.W. Rothman, and S.B. Formal, Escherichia coli O157:H7 Strains Associated with Haemorrhagic Colitis in the United States Produce a Shigella dysenteriae I (Shiga)-like Cytotoxin. Lancet pp O Brien, A.D. and R.K. Holmes Shiga and Shiga-like Toxins. Microbiol. Rev. 51(2): Pai, C.H., R. Gordon, H.Y. Sims, and L.E. Bryan, Sporadic Cases of Haemorrhagic Colitis Associated with Escherichia coli O157:H7. Ann. Intern. Med. 101: Pai, C. H., N. Ahmed, H. Lior, W.M, Johnson, H.V. Sims, and D.E. Woods, Epidemiology of Sporadic Diarrhea Due to Verocytotoxin-Producing Escherichia coli; A Two-year Prospective Study. J. Infect. Dis. 157(5): Riley, L.W., R.S. Remis, S.D. Helgerson, H.B. McGee, J.G. Wells, B.R. Davis, R.J. Hebert, E.S. Olcott, L.M. Johnson, N.T. Hargrett, P.A. Blake, and M.L. Cohen, Haemorrhagic Colitis Associated with a Rare Escherichia coli Serotype. N. Engl. J. Med. 308(12): Scotland, S.M., H.R. Smith, and B. Rowe, Two Distinct Toxins Active on Vero Cells from Escherichia coli O157. Lancet. pp Strockbine, N., L. Marques, J. Newland, H. Williams Smith, R.K. Holmes, and A.D. O Brien, Two Toxin-Producing Phages from Escherichia coli O157:H7 Strain 933 Encode Antigenically Distinct Toxins with Similar Biologic Activities. Infect. Immun. 53(1): Karch, H., et al., Isolation of Enterohaemorrhagic Escherichia coli O157 Strains from Patients with Haemolytic-Uraemic Syndrome by Using Immunomagnetic Separation, DNA-Based Methods, and Direct Culture. JCM, March 1996, 34(3): ProSpecT TM er et registrert varemerke. ATCC er et registrert varemerke som tilhører American Type Culture Collection Oxoid Ltd Wade Road Basingstoke Hants, RG24 8PW Storbritannia Kontakt din lokale forhandler for teknisk støtte. Bruksanvisning X7594, revidert 27. oktober, 2008 Trykt i Storbritannia 5