Probiotika og immunstimulerende midler for å bedre helse SATS PÅ TORSK Nettverksmøte 2011, 9-10 February. Kiron Viswanath

Transkript

1 Probiotika og immunstimulerende midler for å bedre helse SATS PÅ TORSK Nettverksmøte 2011, 9-10 February Kiron Viswanath Faculty of Biosciences and Aquaculture, University of Nordland

2 Sykdommer på torsk: årsaker Utilstrekkelig sykdomsforebygging Intensivt oppdrett Sykdom på torsk Nye sykdommer Interaksjoner mellom oppdretts- og villfisk

3

4 Source: FAO

5 VETERINÆR PROBIOTIKA MENNESKER AKVATISK MILJØ DYR

6 Produksjon av inhiberende forbindelser Konkurranse om adheranse områder PROBIOTIKA Styrking av immunresponsen Konkurranse om næringsstoff; Bidrag som enzymer

7 Lumen Mukus fra goblet celler Apikal surt mikromiljø i tarmepitel Cell turnover Peristalsis Antibakteriell aktivitet i epidermal mukus

8 Disse proteiner gjør epitelceller i stand til å koordinere hendelser i tarmen. Lumen ENTEROCYTT FUNKSJONER Fanger opp makromolekyler Absorberer næring Fungerer som immunceller Tilstedeværelse av reseptorer for bakterielle produkter Uttrykking av overflatemolekyler som inneholder immunoglobulin områder Uttrykker proteiner som har interaksjoner med immunocytter i tarm Concept from Sanderson 2003, NeoReviews 4

9 Terrestrielle probiotiske organismer for akvatisk bruk Nyttige native bakterier? Vert-opphav, fra en akvatisk organisme

10 Start Ufôret Fôret Diversiteten i det bakterielle tarmsamfunnet ble redusert som følge av fôring, mens det var liten forandring ved sulting. Dhanasiri et al Microbial Ecology 61

11 12 Eubacteria (Uncultured bacteria) g-proteobacteria (Photobacterium iliopiscarium strains) α-proteobacteria (Roseobacter sp.) 197 isolater ble undersøkt, 29 (14.8%) var antagonistisk mot Vibrio anguillarum, A. salmonicida.

12 19,3 11,5 69,2 Firmicutes Actinobacteria Others 188 isolater ble undersøkt, 6 (3.2%) var antagonistisk mot Vibrio anguillarum, A. salmonicida subsp. achromogenes og V. salmonicida Lauzon et al. 2008, Vet Microbiol 132

13 Egg/start fôring Colwellia spp. (rapidly disappeared from microbiota) 1. 3 uker med fôring Vibrio logei, V. fischeri & V. anguillarum V. anguillarum, Vibrio sp., Pseudoalteromonas sp. - (larval GI tract) 2. 3 uker med fôring Flexibacter aurantiacus, a species of Sulfitobacter, & putative Mycoplamsa sp (50 th day dominant). Ingen korrelasjon mellom mikrobiota assosiert med levende fôr og i tarm hos torskelarver. Korsnes et al. 2006, ICES J Mar Sci 63 McIntosh et al. 2008, Aquaculture 275

14 Begynnelse av start fôring Innsamling av prøver Overføring av larver ** * * * * * + + * + * + + * + + * + + * + + * Dager etter klekking **0.1 g/l probiotiske bakterier i sjøvann, *0.04g/l probiotiske bakterier i sjøvann +hjuldyr anriket med 12 g blanding med probiotiske bakterier/500,000 hjuldyr H. Sveinsdóttir et al Comp Biochem Physiol 4

15 KONTROLL GRUPPE PROBIOTISK GRUPPE SOMATOLACTIN HMT SOMATOLACTIN HMT Transferrin Transferrin MAPK p38 MAPK p38 MAPK p38 MAPK p38 3 til 3.6 gang nedregulering av immunrelaterte proteiner i probiotisk gruppe. Probiotiske bakterier kan ha utkonkurrert patogene bakterier, som kan ha resultert i lavere uttrykking av immunrelaterte proteiner i denne gruppen. H. Sveinsdóttir et al Comp Biochem Physiol 4

16

17 5 Melkesyre bakterier Log CFU/g Pyloric caeca Intestines LABC LABC+P Torskeyngel (prøver 1 & 2; 5 fisk hver) etter 3 uker på fôr som inneholdt Carnobacterium divergens (LABC); LABC + P gruppe Som også inneholdt immunstimulerende peptider (fiskeprotein hydrolysate) Gildberg & Mikkelsen, 1998, Aquaculture 167

18 A Fisk som er gitt kontrol fôr. B - Fisk som er gitt fôr inneholdende C. divergens Gildberg & Mikkelsen, 1998, Aquaculture 167

19 GP21 & GP12 isolert fra tarm til Atlantisk torsk Aderhanse & koloni overlevelse Stimulering av epitelceller Cellulær Humoral Antagonisme Transkriptsjonelle responser

20 Karakterer undersøkt GP21 GP12 Antagonistisk mot patogener* Bakteriesuspensjon Vibrio anguillarum Aeromonas salmonicida Sterk Svak Svak Moderat Antagonistisk mellom GP21 & GP12 Nei Nei Produksjon av syre Nei Nei Produksjon av sideroforer (enheter) 33% 15% Resistent mot syre (ph 3) Ja Ja Resistent mot galle (5%) Ja Ja Ufarlig for vert Ja Ja * Inhiberingssone : Sterk, > 6 mm; Moderat, 3-6 mm; Svak, < 3mm.

21 Control Live HI 2 1,6 GP21 b b 2 1,6 GP12 b 1,2 0,8 b b 1,2 0,8 b 0,4 a a 0,4 a c a a 0 0 3hpi 24hpi 3hpi 24hpi Relativ ekspresjonsprofiler (gjennomsnitt+sd) av bakterielle forsvarsgener (BPI/LBP) i hodenyre leukocytter co-inkubert med levende og varem-innaktiverte tarmbakterier. (n = 7) Lazado et al. 2010, Comp Biochem Physiol 155

22 15 Ant.intestine Post.intestine Midintestine Rectum Percentage adhesion (%) a b c d a a b b 0 GP21 GP12 N = 3 forsøk i triplikat Lazado et al. 2011, Vet Microbiol, 148

23 Neglesjerbar adhering i for-tarm (~0.2%) Adhering til gjennværende segmenter er nesten den samme ( %) N = 3 førsøk i triplikater Lazado et al. 2011, Vet Microbiol, 148

24 Med tilstedeværelse av GP21 Forbedret adhering til fortarm (økning til 5.5%) Interferanse av adhering gjennom KONKURRANSE N = 3 førsøk i triplikater Lazado et al. 2011, Vet Microbiol, 148

25 Med tilstedeværelse av GP12 Forbedret adhering til fortarm (økning til 8.5%) Interferanse av adhering gjennom EKSKLUDERING N = 3 førsøk i triplikater Lazado et al. 2011, Vet Microbiol, 148

26 Sannsynlig høyere enn A. salmonicida (~2.0%) Høyest adhering til midt-tarm (~13.0%) N = 3 trials in triplicates Lazado et al. 2011, Vet Microbiol, 148

27 Med tilstedeværelse av GP21 IKKE noe definitiv mønster med bakteriell interferanse! N = 3 trials in triplicates Lazado et al. 2011, Vet Microbiol, 148

28 Med tilstedeværelse av GP12 Interferase av adhering gjennom KONKURRANSE (AI, MI og PI) og FORSKYVNING (PI og RC) N = 3 trials in triplicates Lazado et al. 2011, Vet Microbiol, 148

29 Probiotisk GP21 GP12 GENER F H R F H R BPI Hepcidin Lysozyme Galectin Metallothionein IL-1β IL-10 Opp- eller nedregulering sammenlignet med kontrollgruppen, P<0.05

30 Fôring med probiotika med opphav i verten forbedrer evnen fisken har til å inhibere patogener etter 20 dager Transkriptom responser var mer prominente i for-tarmen; men andre regioner ble også funnet å bli stimulert ved opptak av probiotika i fôr

31 Tarm mikrobiota Homeostase Tarm epitelium Tarm immunsystem

32 Immunsystem ikke fullt ut kompetent Fiskelarver Biotisk/abiotisk faktorer SYKDOM Fysiologisk status Biotisk/abiotisk faktorer Juvenile/ Voksne Bærekraftige alternativer Vaksinasjon? Priming av immunsystem innate/ikke-spesifikke forbindelser

33 MAKRO & MIKRONÆRINGSTOFF Aminosyrer, Fettsyrer, Polysakkarider, Mineraler, Vitaminer BIOLOGISKE TILEGG Bakteriell/Sopp derivater Dyr & plante derivater Effektive immunresponser Sykdomsmotstand

34 Vert får bedre motstandskraft mot sykdom Utløser forsvarsmekanismer/veier Aktiverer celler overflate reseptorer Immun stimulant Naturlig forekommende forbindelser Concept from Bricknell & Dalmo, 2005, Fish Shellfish Immunol 19

35 In vitro assays på leukocytter: fagocytose, produksjon av frie radikaler, migrasjon, cytokin produksjon, enzym aktivitet, produksjon av nitric oksid, evne til å drepe bakterier, cytotoxisitet, cell proliferasjon In vivo evaluering: Antistoff produksjon vaksinasjon, overlevelse i smitteforsøk (bakterier/virus), anti-parasitisk effekt, vekstfremming

36 Magnadottir et al. Asa-LPS: A. salmonicida ssp. LPS Ec-LPS: Escherichia coli Lichenan: Et linjært (1 3), (1 4) β-glucan fra Cetraria islandica Thamnolan: Et komplekst heteroglycan fra Thamnolia vermicularis var. subuliformis Chitosan: Crustacean polysakkarider DNA: Fra gjær, Saccharomyces cerevisiae Polymannuronic syre: Fra brunalgen Durvillea antarctica Laminarin: Fra algen Laminaria digitata Levamisol: En syntetisk stimulant Vitamin C: Askorbinsyre Oil: Fra torskelever Magnadottir et al. 2006, J Fish Dis 29

37 Dødelighet (%) ved 5.5 C Dødelighet (%) ved 10 C 90 Control Asa-LPS 90 Smitte med Asa (2x10 5 cfu/ml) dph 51dph Control (5.3g) Ass-LPS (6.2g) Asa-LPS behandling foredret motstand mot sykdom Magnadottir et al. 2006, J Fish Dis 29

38 Overlevelse (%) ved 27 dph Overlevelse (%) ved dag * * Control Diatom glucan Yeast glucan Control Diatom glucan H M Alginate Skjermo et al. 2006, Aquaculture 261

39 Dybdeforståelse av substansene som stimulerer Kunnskap om reseptorer i vertens celler som kan gjennkjenne og respondere på disse substansene Kartlegge responsene i humorale markører som er lette å måle Dokumenterte effekter praktisk bruk i oppdrett Functional feeds?

40 TAKK TIL FORSKNINGSRÅDET (Prosjektene: Preventive Health Care of Farmed Fish; Mucosal Immune System of Atlantic Cod Creating a Knowledge Base) HAVFORSKNINGSINSTITUTTET (Øivind Bergh, Hari Rudra, Rolf Hetlelid Olsen, Ann Cathrine Einen) Anusha Dhanasiri Carlo Lazado Christopher Caipang Kjetil Korsnes Hilde Ribe Ingvild Berg Monica Brinchmann