Hvilke mikroorganismer finnes i biofilmer?

Transkript

1 Hvilke mikroorganismer finnes i biofilmer? Øyvin Østensvik Institutt for mattrygghet og infeksjonsbiologi Fagtreff 16. november 2009

2 Bacterial Adhesion: Seen Any Good Biofilms Lately? Given their druthers, bacteria prefer a community-based, surface-bound, sedentary lifestyle to a nomadic existence. W. Michael Dunne, Jr. CLINICAL MICROBIOLOGY REVIEWS, Apr. 2002, p

3 Temaer Biofilm ikke bare i vannledninger Litteraturstudier Biofilm i vannledninger Egne undersøkelser på NVH Høydebasseng Ledningsnett PEX-prosjektet

4 Biofilm i kraftfôrfabrikker MSc Lene Karine Vestby disputerte 5. november 2009 for graden Ph.D ved Norges veterinærhøgskole med avhandlingen: Biofilm formation by Salmonella from the Norwegian feed industry with attention to potential persistence and eradication. Enkelte Salmonella har klart å etablere seg i noen fôrfabrikker og har blitt værende der i flere år uten at man har klart å bli kvitt dem. Biofilm av Salmonella på agar Foto: Nesse & Vestby, Veterinærinstituttet Salmonellabakterier som var gode til å danne biofilm (bakteriebelegg) overlevde lenger i fôrfabrikkene enn de som var dårlige til å danne dette belegget. Evnen til å overleve i fabrikkene ser derfor ut til å ha sammenheng med evnen til å danne biofilm, og det ser ut til at man må klare å bekjempe biofilm for å bli kvitt Salmonella i fabrikkene. Effekten av de aller fleste desinfeksjonsmidlene var ikke lenger tilfredsstillende, men et produkt som innholdt 70 % etanol var det mest effektive, etterfulgt av et produkt med navn Virkon S. Elektronmikroskop bilde av Salmonella i biofilm Foto: Vestby & Nesse, Veterinærinstituttet Kommunikasjon mellom bakteriene (quorum sensing) er viktig for at de skal klare å danne biofilm. De senere årene har man utviklet såkalte furanoner som er kjent for å hemme bakteriekommunikasjon og dermed også hemme dannelse og modning av biofilm. Vestby har vist at et slikt furanon kan være et nyttig redskap i kampen mot Salmonella i fabrikkmiljøet. Furanonet hindret salmonellabakteriene i å danne en fullverdig biofilm, og dermed ble de dårligere beskyttet mot desinfeksjonsmidler. Resultatet ble at desinfeksjonsmidlene virket bedre.

5 Temadag 25. november 2009 Biofilm - en trussel for oljeindustrien? Oljeindustriens landsforening (OLF) og Universitetet for miljø- og biovitenskap inviterer til temadag med tittelen Biofilm en trussel for oljeindustrien?" Miljøvennlig hydraulikk- og smøreoljer kombinert med luft og vann gir biofilm på roterende utstyr og hydraulikk Valhallfeltet har vært stengt i mange uker på grunn av korrodering av produsjonsrør En ventil i oppløsning pga.bakterievekst. biofilm Foto: Fras Technology HMS-utfordringer blant annet knyttet til hissig hudutslett, ørebetennelse og infeksjonssykdommer i luftveiene til dykkere

6 Biofilm i drikkevannsledninger Mikroorganismer i rentvann Mikroorganismer som tilføres ledningsnett gjennom utette rør Biofilmdannelse Mikroorganismer i vannet Mikroorganismer i biofilm

7 Mikroorganismer i biofilm Kan forekomme som: 1: Levende med vekst og formering 2: Levende men ikke dyrkbare (VBNC)

8 Journal of Bacteriology 32: (1936) STUDIES OF FRESHWATER BACTERIA III. QUANTITATIVE ASPECTS OF THE DIRECT MICROSCOPIC METHOD" ARTHUR T. HENRICI Laboratories of Bacteriology at the University of Minnesota, Minneapolis, and at Station-on-Alexander, Cushing, Minnesota Received for publication April 4, 1936 In the first paper of this series (Henrici, 1933), there was described a procedure for studying the distribution of bacteria in freshwater habitats, which consisted in immersing microscopic slides in water for a period of time, removing them, and examining the stained preparations under the microscope. It was proposed that this method might be used quantitatively to determine microbic activity in a given habitat, the number of bacteria deposited upon a unit area of glass in a unit period of time serving as a measure of this activity. However, this measure cannot be so used until something is known about its limitations and reliability, and until certain factors, such as optimum duration of immersion, area of slide to be examined, etc., have been determined.

9 Figur 2 i Henricis artikkel fra 1936

10 Detection of Escherichia coli in Biofilms from Pipe Samples and Coupons in Drinking Water Distribution Networks T. Juhna, et al. (2007) APPL. ENVIRON. MICROBIOL. 73: Materiale: Ledningsnett/Gamle vannrør (n=6) og kuponger (n=44) Metode: Direkte påvisning av E. coli med FISH (Fluorescens In Situ Hybridisering) Dyrkingsmetode: ISO (Laktose TTC Agar med Tergitol 7) og Rapid E. coli 2 Agar (β-d-glucuronidase) Resultat: Vannledninger: FISH: Påvist E. coli i 5 av 6 prøver. Dyrking 1 av 6 prøver Kuponger: FISH: E. coli påvist fra 58 %. Dyrking: E. coli ikke påvist. Konklusjon: E. coli kan etablere seg i biofilm. Metabolsk inaktive. Påvises ikke ved rutineundersøkelser.

11 Formation of natural biofilms during chlorine dioxide and u.v. disinfection in a public drinkingwater distribution system T. Schwartz, S. Hoffmann and U. Obst (2003) J Appl Microb. 95: Materiale: Vannverk. Biofilm registrert på ledningsnettet. To perioder - ulik desinfeksjon Metode: Direkte bakteriefarging (CTC og DAPI) og In situ hybridisering(fish)/spesifikk PCR-hybridisering Dyrking: Kimtall og enterokokker Robbins sylinder Resultater: Mer biofilm og gjenvekst etter UV sammenlignet med Chlorin diokside Enterokokkene passerte UV, men ble inaktivert av klor

12 Investigation of natural biofilms formed during the production of drinking water from surface water embankment filtration Farahnaz Emtiazi et al (2004) Water Res 38: Materiale: Ledningsnett, vannforsyning, sandfiltrering/uv Robbins sylinder Metoder: PCR/DGGE (Populasjonsstudier) PCR/Spesifikk hybridisering (Opportunistisk patogene bakterier) Bakterietelling (DAPI) og enzym-måling S. Kalmbach et al. (1997)/FEMS Microbiol.Ecol.22: Resultater: PCR/DGGE: Samfunn tilhørende β-proteobacteria PCR/Spesifikk hybridisering: Påvist Saprofytiske mykobakterier, Legionella spp., Pseudomonas aeruginosa Ikke påvist: Legionella pneumophila, Enterococcus faecalis, E. faecium Konklusjoner: Klar sammenheng mellom mikrofloraen i råvann og i biofilm på ledningsnettet. Sandfiltrering/UV hindret ikke etablering av opportunistisk patogene bakterier i biofilm

13 Dyrkning av bakterier i biofilm - generelt To dyrkingsmedier Kimtallsagar (PGA eller R2A-agar) Blodagar Utsæd Overflatespredning av 0,1 ml Gir mulighet for å skille mellom ulike morfologiske grupper Inkubasjonstemperatur Primært 22 C (Psykrotrofe/Psykrofile)

14 Dyrkning av bakterier i biofilm spesifikke bakterier Koliforme bakterier og Escherichia coli Laktose TTC Agar med Tergitol 7 Aerobe sporedannere (Bacillus spp.) Blodagar pasteuriserte prøver Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas agar med CN Aeromonas spp. (Aer. hydrophila) Stivelse Ampicillin Agar (SAA)

15 Biofilm dyrking av bakterier Blodagar Kimtallsagar

16 Resultater egne undersøkelser Årstall Prøvested Problemstilling Resultat 2004 Vannbehandling, Membranfiltrering Høye kimtall og påvst koliforme bakterier etter filtrering Biofilmdannelse. 93 % Klebsiella pneumoniae 7 % Enterobacter cloacae 2003 Høydebasseng Biofilm, Bacillus Påvist Bacillus spp. og Bacillus cereus 2004 Høydebasseng Høye kimtall Påvist tilnærmet renkultur av Brevundimonas diminuta 2004 Høydebasseng Biofilm Påvist blandingsflora. Pseudomonas spp., Chryseomonas luteola, Stenotrophomonas maltophila 2003 Ledningsnett, etter UV Vann Påvist Sphingomonas paucimobilis 2003 Vann Påvist Sphingomonas paucimobilis, Ochrobactrum anthropi 2004 Vann Påvist Burkholderia cepacia Moraxella spp. Pseudomonas fluorescens Comamonas testosteroni

17 Resultater PEX-prosjektet (1) Følgende bakterier/bakteriegrupper ble ikke påvist ved dyrkning: Koliforme bakterier og Escherichia coli Aerobe sporedannere Pseudomonas aeruginosa Aeromonas spp. Vi registrerte bare vekst på Blodagar og R2A-agar Betydelig høyere kolonitall på R2A sammenlignet med Blodagar Ca. 100 isolater fra biofilmen ble frosset ned. Forsøkt identifiserte ved hjelp av fenotypiske tester (API 20 NE og API 20 E)

18 Resultater PEX-prosjektet (2) Bakterie-ID (API): Til dels svært usikre identifiseringer Majoriteten av isolatene var: Gram negative stavbakterier Aerobe Oxidase negative (ca 70 %) Non-fermenters (forgjærer ikke ulike sukkerarter)

19 Resultater PEX-prosjektet (3) Bakterier påvist i biofilmen noen eksempler: Flavobacterium spp. Pasteurella spp. Sphingomonas paucimobilis Xanthomonas maltophila Moraxella spp. Oligella urethralis Brevundimonas vesicularis Stenotrophomonas maltophila Acinetobacter spp. De fleste av disse er opportunistisk patogene

20

21 Aeromonas hydrophila Gram negativ, fakultativt anaerob stavbakterie Naturlig reservoar: Jord og vann Tre typer infeksjoner: 1. Diarésykdommer (Kilde: Vann og mat) 2. Bakteremi Septikemi 3. Sårinfeksjoner Sammenheng mellom Aer. hydrophila i drikkevann og sykehusinfeksjoner

22 Sphingomonas paucimobilis Tidligere: Pseudomonas paucimobilis Gram-Negativ, aerob stavbakterie, Oksidase positiv Produserer gult pigment Naturlig reservoar: Jord og vann Kan være UV-resistent To typer infeksjoner 1. Sporadisk: Bakteremi, Meningit, urinveisinfeksjon, sårinfeksjon 2. Sykehusinfeksjoner: Kontaminerte infusjonsvæsker Kontaminerte katetere

23 Stenotrophomonas maltophila Tidligere: Pseudomonas maltophila Reservoar: Vann, jord, planter Isolert fra pasienter med en lang rekke kliniske tilstander Luftveisinfeksjoner Urinveisinfeksjoner Endokarditt Sårinfeksjoner Bakteremi

24 Burkholderia cepacia Tidligere: Pseudomonas cepacia Reservoar: Vann, sedimenter, planter Plantepatogen: Bløtråte hos løk Fra ca Hyppig isolert fra pasienter med cystisk fibrose Kan aksellerere og akuttisere lungesykdom Nekrotisk pneumoni og sepsis Cepacia-syndromet

25 Klebsiella pneumoniae Koliform bakterie: Laktose +, Gram negativ, fakultativt anaerob, oksidase negativ stavbakterie Reservoar: Ubikvitær Miljø: Jord, vann, planter Slimhinner fra varmblodige dyr og mennesker Sjukehusstammer ofte multiresistente Kliniske tilstander: Luftveisinfeksjoner Urinveisinfeksjoner