(12) Oversettelse av europeisk patentskrift

Transkript

1 (12) Oversettelse av europeisk patentskrift (11) NO/EP B1 (19) NO NORGE (51) Int Cl. C12Q 1/68 ( ) Patentstyret (21) Oversettelse publisert (80) Dato for Den Europeiske Patentmyndighets publisering av det meddelte patentet (86) Europeisk søknadsnr (86) Europeisk innleveringsdag (87) Den europeiske søknadens Publiseringsdato (30) Prioritet , US, P (84) Utpekte stater AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MT NL NO PL PT RO SE SI SK TR (73) Innehaver Roche Diagnostics GmbH, Sandhofer Strasse 116, Mannheim, DE-Tyskland F.Hoffmann-La Roche AG, Grenzacherstrasse 124, 4070 Basel, CH-Sveits (72) Oppfinner Langland, Rachel, th Avenue, Oakland, CA 94601, US-USA Sharp, Thad, 220 Rutgers Lane, Parsippany, NJ 07054, US-USA Will, Stephen, 1832 Woodhaven Way, Oakland, CA 94611, US-USA Wu, Lin, 700 Crossbrook Drive, Moraga, CA 94556, US-USA (74) Fullmektig Tandbergs Patentkontor AS, Postboks 1570 Vika, 0118 OSLO, Norge (54) Benevnelse Diagnosetest for mottakelighet for B-Raf kinaseinhibitorer (56) Anførte publikasjoner WO-A-2004/029288, WO-A-2004/080464, WO-A-2005/ WO-A-2005/059171, WO-A2-2005/074350, US-A RACHEL LANGLAND, THAD SHARP, JAMES TSAI, MICKEY WILLIAMS AND LIN WU: "Development of a companion diagnostic test for inhibitors of V600E BRAF"[Online] 15 September 2006 ( ), XP Retrieved from the Internet: URL: ntent/abstract/2006/2/a13> [retrieved on ] BENLLOCH SUSANA ET AL: "Detection of BRAF V600E mutation in colorectal cancer: Comparison of automatic sequencing and real-time chemistry methodology" JOURNAL OF MOLECULAR DIAGNOSTICS, vol. 8, no. 5, November 2006 ( ), pages , XP ISSN: JIN LONG ET AL: "BRAF mutation analysis in fine needle aspiration (FNA) cytology of the thyroid" DIAGNOSTIC MOLECULAR PATHOLOGY, NEW YORK, NY, US, vol. 15, no. 3, 1 September 2006 ( ), pages , XP IKENOUE TSUNEO ET AL: "Rapid detection of mutations in the BRAF gene using real-time polymerase chain reaction and melting curve analysis." CANCER GENETICS AND CYTOGENETICS, vol. 149, no. 1, February 2004 ( ), pages 68-71, XP ISSN: JARRY A ET AL: "Real-time allele-specific amplification for sensitive detection of the BRAF mutation V600E" MOLECULAR AND CELLULAR PROBES, ACADEMIC PRESS, LONDON, GB, vol. 18, no. 5, 1 October 2004 ( ), pages , XP ISSN: "Plexxikon and Roche enter partnership to develop targeted cancer therapeutic medicine PLX4032"[Online] 4 October 2006 ( ), XP Retrieved from the Internet: URL: nt/2006/pr html> [retrieved on ]

2 1 Beskrivelse BAKGRUNN TIL OPPFINNELSEN [0001] BRAF genet koder for B-Raf, en serin/treonin kinase som kobler signalisering fra aktiverte RAS til nedstrøms MAPK kinaser (Wellbrock et al., Cancer Res. 64: , 2004). Onkogene mutasjoner i B-Raf resulterer i en tjent kinasefunksjon, som gjør Raf-MEK-ERK veien konstitutivt aktiv i fraværet av vanlige vekstfaktorer. Denne konstitutive aktiveringen samsvarer med en dårlig prognose i metastatisk melanoma (Houben et al., 2004, supra). Aktiverende mutasjoner i BRAF er rapportert i flere malignitetsgrader. For eksempel finnes mutasjoner i BRAF i så mange som 70 % av menneskelig melanoma tilfeller. En enkelt-base mutasjon (T>A) ved nukleotidposisjon 1799 i kodon 600 av ekson 15 fører til en valin-til-glutamat substitusjon (V600E), som finnes i mer enn 85 % av melanoma med en mutasjon i B- Raf (Davies et al., Nature 417: , 2002; Garnett and Marais, Cancer Cell 6: , 2004; Gray-Schopfer et al., Cancer Metastasis Rev. 24: , 2005; Houben et al., 2004). Det er mindre vanlig at V600E resulterer fra en to-base mutasjon TG>AA ved nukleotidposisjon (Houben et al., J Carcinog. 3:6, 2004). [0002] Et antall av kinaseinhibitorer er kjent, inkludert de som inhiberer B-Raf. Slike inhibitorer inkluderer PLX4032, som selektivt inhiberer B-Raf V600E kinaseaktivitet. Den foreliggende oppfinnelsen fremskaffer metoder for å identifisere V600E-positive pasienter som plukkes ut for behandling ved å bruke en B-Raf kinaseinhibitor, e.g., PLX4032. [0003] LANGLAND et al., 2006 ("Development of a companion diagnostic test for inhibitors of V600E BRAF", URL: legger frem en metode for å fastslå sensitiviteten til kreftceller for PLX4032 basert på oppdagelsen av BRAF V600E mutasjonen ved TaqMan PCR i sanntid. Likevel er ingen spesifikke primere eller sensorsekvenser fremlagt. KORT OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN [0004] Oppfinnelsen fremskaffer metoder og sett for oppdagelsen av pasienter som er kandidater for behandling med en B-Raf kinaseinhibitor. Derfor, i et aspekt, fremskaffer oppfinnelsen en metode for å fastslå sensitiviteten til kreftcellene for en B- Raf inhibitor, metoden omfatter: (i) å fremskaffe en nukleinsyreprøve fra kreftceller fra en pasient som har kreft; (ii) å amplifisere en spesifikk polynukleotidsekvens i nukleinsyreprøven ved å bruke et primerpar som amplifiserer den spesifikke

3 2 polynukleotidsekvensen, hvor den spesifikke polynukleotidsekvensen inneholder en V600E, en V600D eller en V600K mutasjonsted i BRAF og amplifiseringen utføres med tilstedeværelse av en merket oligonukleotidprobe som inneholder sekvensen vist i SEQ ID NO:1 hvor «n» er deoksyinosin, og oppdager tilstedeværelsen av en mutert sekvens ved V600E mutasjonsstedet i BRAF; og (iii) å oppdage tilstedeværelsen eller fraværet av en V600E, eller V600D eller V600K mutasjon i BRAF; dermed fastslås sensitiviteten av kreften for B-Raf inhibitoren. I noen utførelsesformer, har proben nukleotidsekvensen vist i SEQ ID NO:1. Amplifiseringen kan utføres med tilstedeværelse av en andre probe som oppdager tilstedeværelsen av villtypesekvensen på V600E mutasjonsstedet. I noen utførelsesformer, inneholder den andre proben minst 15 nukleotider fra SEQ ID NO:2. I noen utførelsesformer har den andre proben nukleotidsekvensen vist i SEQ ID NO:2. I noen utførelsesformer kan proben merkes med et fluorescerende merke. Proben kan også merkes med to merker, hvor et av merkene er et fluorescerende fargestoff og det andre merket er en slukkende halvdel. [0005] I noen utførelsesformer hybridiseres begge primerne i primerparet brukt i amplifiseringsreaksjonen til ekson 15 av BRAF. I noen utførelsesformer, inneholder en av primerne i primerparet brukt i amplifiseringsreaksjonen minst 15 sammenhengende nukleotider fra nukleotidsekvensen vist i SEQ ID NO:3, f.eks., en av primerne i primerparet kan ha nukleotidsekvensen vist i SEQ ID NO:3. I ytterligere utførelsesformer inneholder en av primerne i primerparet minst 15 sammenhengende nukleotider fra nukleotidsekvensen vist i SEQ ID NO:4. For eksempel kan primeren ha nukleotidsekvensen vist i SEQ ID NO:4. I ytterligere utførelsesformer inneholder primerparet som brukes i amplifiseringen primere som har nukleotidsekvensen vist i SEQ ID NO:3 og SEQ ID NO:4. [0006] I noen utførelsesformer omfatter amplifiseringsskrittet av reaksjonen en RT- PCR. [0007] Metoden kan brukes til å oppdage krefttyper som har en mutasjon ved aminsyreposisjon 600 av B-Raf, f.eks., en V600E mutasjon. I noen utførelsesformer er krefttypen melanoma. I andre utførelsesformer er krefttypen tykktarmskreft eller skjoldbukskjertelkreft. I noen utførelsesformer kan nukleinsyreprøven som brukes i metoden ifølge oppfinnelsen til å oppdage mutasjonen være fra en hudbiopsi. I andre utførelsesformer er prøven fra en tykktarmsbiopsi. Prøven kan også komme fra parafininnleiret vev. Metoden ifølge oppfinnelsen kan videre omfatte opptegnelse av en diagnose hvor pasienten er sensitiv til en B-Raf inhibitor, slik som en mutasjonsspesifikk B-Raf inhibitor, f.eks., PLX4032. [0008] I noen utførelsesformer av redegjørelsen omfatter metoden videre administrering av en B-Raf inhibitor til pasienten. B-Raf inhibitoren kan være en mutasjonsspesifikk B-Raf inhibitor slik som, PLX4032.

4 3 [0009] I et annet aspekt, fremskaffer redegjørelsen en metode for å identifisere en PLX4032 behandlingskandidat, metoden omfatter: fremskaffe en prøve fra subjektet; og oppdage et biomolekyl som inneholder en BRAF V600E mutasjon fra prøven, og dermed identifisere PLX4032 behandlingskandidaten. I noen utførelsesformer er biomolekylet en nukleinsyre. I andre utførelsesformer er biomolekylet en polypeptid. Polypeptiden kan oppnås, f.eks., fra en prøve som inneholder kreftceller fra pasienten. I noen utførelsesformer kan polypeptiden oppdages ved å bruke en immunologisk analyse. Metoden kan også omfatte administreringen av PLX4032 til pasienten. [0010] I et annet aspekt fremskaffer oppfinnelsen et sett for å oppdage en pasient som er en kandidat for behandling med en B-Raf inhibitor, hvor settet inneholder en første allel-spesifikk probe, hvor den første proben er egnet for å oppdage en V600E, en V600D eller en V600K mutasjon i BRAF og inneholder sekvensen vist i SEQ ID NO:1. I noen utførelsesformer har proben nukleotidsekvensen vist i SEQ ID NO:1. Et sett ifølge oppfinnelsen kan videre omfatte en andre allel-spesifikk probe, hvor den andre proben oppdager villtypesekvensen av BRAF og inneholder minst 15 sammenhengende fra nukleotidsekvensen vist i SEQ ID NO:2. I noen utførelsesformer har den andre proben nukleotidsekvensen vist i SEQ ID NO:2. [0011] I ytterligere utførelsesformer inneholder et sett ifølge oppfinnelsen et primerpar som amplifiserer et målområdet av BRAF som inneholder et V600E mutasjonssted. For eksempel kan primerparet inneholde en primer som inneholder minst 15 sammenhengende nukleotider fra nukleotidsekvensen vist i SEQ ID NO:3. I noen aspekter har primeren nukleotidsekvensen vist i SEQ ID NO:3. I andre utførelsesformer kan primerparet omfatte primere som inneholder minst 15 sammenhengende nukleotider fra nukleotidsekvensen vist i SEQ ID NO:3 og SEQ ID NO:4. I noen utførelsesformer omfatter primerparet primere som har nukleotidsekvensene vist i SEQ ID NO:3 og SEQ ID NO:4. [0012] Derfor, i noen utførelsesformer, kan et sett ifølge oppfinnelsen omfatte: en probe som har nukleotidsekvensen vist i SEQ ID NO:1; en probe som har nukleotidsekvensen vist i SEQ ID NO:2; en primer som har nukleotidsekvensen vist i SEQ ID NO:3; og en primer som har nukleotidsekvensen vist i SEQ ID NO:4. KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE [0013] Figur 1 viser en justering av en B-Raf V600E amplicon (SEQ ID NO:5) med et samsvarende område av kromosom X (SEQ ID NO:6). B-Raf V600E primerstedet vises med piler. Ampliconet inkluderer deler av ekson 15 (store

5 4 bokstaver) og intron 15 (små bokstaver). Vertikale stolper viser identitetsposisjoner mellom BRAF og kromosom X sekvenser. Kodon 600 er innrammet; GTG tilsvarer valin (V). Probebindingsområdet fremheves ved skyggelegging; mutasjonsproben (MU) er lengre enn villtypeproben (WT) med to nukleotider (5 -CT i det fremhevede området) og begge probene binder til komplementet av sekvensen som vises her. Figur 2 viser en justering av et B-Raf ekson 15 området som omringer kodon 600 (pil) (SEQ ID NO:7) med homologe områder av A-Raf (SEQ ID NO:8) og C-Raf (SEQ ID NO:9). Asterisker betegner aminosyreforskjeller relativ til B-Raf sekvensen (f.eks., Mercer & Pritchard, Biochim Biophys Acta 1653:25-40,2003). Figur 3 viser en justering av B-Raf V600E amplicon (SEQ ID NO:5) med samsvarende sekvenser fra ARAF (som koder A-Raf) (SEQ ID NO:11) og RAF1 (som koder C-Raf) (SEQ ID NO:10) gen. Nukleotider i små bokstaver er forskjellige fra BRAF sekvensen. DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN Definisjoner [0014] I forbindelse med denne søknaden, referer en «V600E» til en mutasjon i BRAF (T>A ved nukleotidposisjon 1799) som resulterer i substitusjonen av en glutamin for en valin ved aminosyreposisjon 600 av B-Raf. «V600E» er også kjent som «V599E» (1796 T>A) under et tidligere nummereringssystem (Kumar et al., Clin. Cancer Res. 9: , 2003). [0015] I forbindelse med denne oppfinnelsen, inhiberer en B-Raf kinaseinhibitor aktiviteten til en B-Raf kinase. En slik inhibitor kan også inhibere aktiviteten til andre kinaser, inkludert andre raf kinaser. [0016] En «mutasjonsspesifikk B-Raf kinaseinhibitor» som brukt her referer til en B- Raf inhibitor som har selektivitet for en mutert B-Raf slik som B-Raf som har en mutasjon på valinresiduet ved aminosyreposisjon 600, f.eks., en V600E mutasjon, sammenlignet med en villtype B-Raf. En slik inhibitor er minst to ganger, oftere minst tre ganger, eller mer potent som inhibitor av mutert B-Raf, f.eks., en B-Raf som har en V600E mutasjon, sammenlignet med villtypen. For eksempel, i noen utførelsesformer, kan en «mutasjonsspesifikk B-Raf inhibitor» ha en IC 50 for kinaseinhibisjonsaktivitet (biokjemisk analyse) på rundt 30 nm for V600E B-Raf mens den tilsvarende IC 50 for

6 5 villtype B-Raf er rundt 100 nm. Potensen kan også sammenlignes med IC 50 verdier for cellulære analyser, f.eks., cellulære analyser som måler vekstinhibisjon. En «mutasjonsspesifikk B-Raf inhibitor» i forbindelse med denne oppfinnelsen kan også inhibere andre kinaser enn B-Raf, f.eks., andre raf kinaser. [0017] Uttrykket «hybridisering» refererer til dannelsen av en todelt struktur av to enkelttrådete nukleinsyrer på grunn av komplementær baseparring. Hybridisering kan oppstå mellom nøyaktig komplementære nukleinsyretråder eller mellom nukleinsyretråder som inneholder mindre områder som ikke samsvarer. Som brukt her refererer uttrykket «betydelig komplementær» til sekvenser som er komplementære med unntak av mindre områder som ikke samsvarer. Det er typisk at det totale antallet av nukleotider som ikke samsvarer over et hybridiseringsområdet ikke er mer enn 3 nukleotider for sekvenser som er rundt 15 nukleotider lange. Forhold hvor kun nøyaktig komplementære nukleinsyretråder vil hybridisere refereres til som «strenge» eller «sekvensspesifikke» hybridiseringsforhold. Stabile todelte strukturer av betydelig komplementære nukleinsyrer kan oppnås under mindre strenge hybridiseringsforhold. Fagpersoner av nukleinsyreteknologi kan fastsette dupleks stabilitet av erfaring ved ta flere variabler i betrakting inkludert, for eksempel, lengden og basepar konsentrasjonen av oligonukleotidene, ionstyrke, og forekomst av basepar som ikke samsvarer. For eksempel er PC programvare for å kalkulere dupleks stabilitet kommersielt tilgjengelig fra National Biosciences, Inc. (Plymouth, Minn.); f.eks., OLIGO versjon 5, eller fra DNA programvare (Ann Arbor, Michigan), f.eks., Visual OMP 6. [0018] Strenge, sekvensspesifikke hybridiseringsforhold, hvor en oligonukleotid vil hybridisere kun med den nøyaktig komplementære målsekvensen, er velkjente i fagfeltet (se, f.eks., den generelle referansen fremskaffet i seksjonen om oppdagelse av polymorfisme i nukleinsyresekvenser). Strenge forhold er sekvensspesifikke og vil være forskjellige under forskjellige omstendigheter. Som regel velges strenge forhold til å være rundt 5 C lavere enn det termiske smeltepunktet (Tm) til den spesifikke sekvensen ved en definert ionstyrke og ph. Tm er temperaturen (under definert ionstyrke og ph) hvor 50 % av baseparene dissosieres. Slakking av strengheten av hybridiseringsforholdene vil gjøre at sekvenser som ikke samsvarer vil tolereres; graden av misforhold som tolereres kan kontrolleres ved egnet regulering av hybridiseringsforholdene. [0019] Uttrykket «primer» refererer til en oligonukleotid som fungerer som startpunkt for DNA syntese under forhold hvor syntese av et primer ekstensjonsprodukt komplementært til en nukleinsyretråd fremkalles, dvs., med tilstedeværelse av fire forskjellige nukleosidtrifosfater og et middel for polymerisering (dvs., DNA polymerase eller omvendt transkriptase) i en egent buffer og ved en egnet temperatur. En primer er fortrinnsvis en enkelttrådet oligodeoksyribonukleotid. Primeren

7 6 inkluderer et «hybridiseringsområdet» nøyaktig eller betydelig komplementær til målsekvensen, fortrinnsvis på rundt 15 til rundt 35 nukleotider i lengde. En primer oligonukleotid kan enten bestå kun av hybridiseringsområdet eller den kan bestå av ytterligere egenskaper som gjør det mulig å oppdage, immobilisere eller manipulere det amplifiserte produktet, men som ikke forandrer egenskapen til primeren til å fungere som en startreagens for DNA syntese. For eksempel kan halen til en nukleinsyresekvens inkluderes ved 5 enden av primeren som hybridiserer med en fanget oligonukleotid. [0020] En «allelspesifikk» primer, som brukt her, er en primer som hybridiserer med en målsekvens slik at 3 enden, vanligvis 3 nukleotidet, av primeren rettes inn med et sted av interesse, f.eks., nukleotid 1799, som er den andre posisjonen i kodon 600 av BRAF, og som er nøyaktig komplementær med enten villtypeallelet eller mutantallelet ved posisjonen av interesse. Som brukt her er primeren «spesifikk for» allelet som den er nøyaktig komplementær med ved 3 enden, f.eks., ved 3 nukleotidet eller det nest siste nukleotidet. Vanligvis inhiberes primer ekstensjon når et misforhold er til stede ved 3 enden av primeren. En allelspesifikk primer, når den er hybridisert med det nøyaktig komplementære allelet, er forlengbar med større effektivitet. Den samme primeren, når den er hybridisert med det andre allelet, er ikke så enkelt forlengbar på grunn av misforholdet ved 3 enden, f.eks., 3 nukleotidet eller det nest siste nukleotidet ved 3 enden, av primeren i hybridiseringsduplekset. Derfor fremskaffer bruken av en allelspesifikk primer allelisk distinksjon basert på forskjellig dannelse av et ekstensjonsprodukt. [0021] Uttrykket «probe» referere til en oligonukleotid som selektivt hybridiserer med en mål-nukleinsyre under egnede forhold. [0022] En «allelspesifikk» probe inneholder et «hybridiseringsområdet» nøyaktig eller betydelig komplementært med målsekvensen, og som er nøyaktig komplementær med målsekvensen ved stedet av interesse, f.eks., nukleotid 1799 i kodon 600 av BRAF. Dermed, for eksempel, vil en V600E allelspesifikk probe selektivt oppdage en V600E mutasjonssekvens, mens en villtype BRAF allelspesifikk probe selektivt oppdager villtypesekvensen. En hybridiseringsanalyse som utføres ved å bruke proben under tilstrekkelig strenge hybridiseringsforhold muliggjør den selektive oppdagelsen av en spesifikk målsekvens som inneholder stedet av interesse. Probens hybridiseringsområdet er fortrinnsvis fra rundt 10 til rundt 35 nukleotider i lengde, og aller helst fra rundt 15 til rundt 35 nukleotider i lengde. Bruken av modifiserte baser eller baseanaloger som påvirker hybridiseringsstabiliteten, som er velkjente i fagfeltet, kan gjøre det mulig å bruke kortere eller lengre prober med sammenlignbar stabilitet. En probes oligonukleotid kan enten bestå kun av hybridiseringsområdet eller den kan inneholde ytterligere egenskaper som gjør det mulig å oppdage eller immobilisere

8 7 proben, men som ikke betydelig forandrer hybridiseringskarakteristikkene av hybridiseringsområdet. [0023] Uttrykket «målsekvens» eller «målområdet» refererer til et område av en nukleinsyre som skal analyseres og som inneholder det polymorfe stedet av interesse. [0024] Som brukt her referer uttrykkene «nukleinsyre», «polynukleotid» og «oligonukleotid» til primere, prober og oligomerfragmenter. Uttrykkene er ikke begrenset av lengde og er generiske til lineære polymerer av polydeoksyribonukleotider (som inneholder 2-deoksy-D-ribose), polyribonukleotider (som inneholder D-ribose), og ethvert annet N-glykosid av en purin- eller pyrimidinbase. Disse uttrykkene inkluderer dobbel- og enkelttrådet DNA, så vel som dobbel- og enkelttrådet RNA. Oligonukleotider ifølge oppfinnelsen kan brukes som primere og/eller prober. [0025] En nukleinsyre, polynukleotid eller oligonukleotid kan inneholde fosfodiesterkoplinger eller modifiserte koplinger inkludert, men ikke begrenset til fosfotriester, fosforamidat, siloksan, karbonat, karboksymetylester, acetamidat, karbamat, tioeter, brokoblet fosfortioat eller sulfonkoplinger, og kombinasjoner av slike koplinger. [0026] En nukleinsyre, polynukleotid eller oligonukleotid kan inneholde de fem biologisk forekommende basene (adenin, guanin, tymin, cytosin og uracil) og/eller andre baser enn de fem biologiske forekommende basene. Disse basene kan ha flere formål, f.eks., å stabilisere eller destabilisere hybridisering; fremme eller inhibere nedbryting av prober; eller som festepunkter for påviselige halvdeler eller slukker halvdeler. For eksempel, en polynukleotid ifølge oppfinnelsen kan inneholde en eller flere modifiserte, ikke-standard, eller derivatiserte basehalvdeler, inkludert, men ikke begrenset til, N6-metyladenin, N6-tert-butyl-benzyl-adenin, imidazol, substituerte imidazoler, 5-fluoruracil, 5-bromuracil, 5-kloruracil, 5-joduracil, hypoxantin, xantin, 4-acetylcytosin, 5 (karboksyhydroksymetyl)uracil, 5-carboksymethylaminometyl2- tiouradin, 5-karboksymetylaminometyluracil, dihydrouracil, beta-d-galaktosylquosin, inosin, N6 isopentenyladenin, 1-metylguanin, 1-metylinosin, 2,2-dimetylguanin, 2- metyladenin, 2-metylguanin, 3-metylcytosin, 5-metylcytosin, N6-metyladenin, 7- metylguanin, 5-metylaminometyluracil, 5-metoksyaminometyl-2-tiouracil, beta-d mannosylqueosin, 5 -metoksykarboksymetyluracil, 5-metoksyuracil, 2-metyltio-N6- isopentenyladenin, uracil-5-oksyeddiksyre (v), wybutoksin, pseudouracil, queosin, 2- tiocytosin, 5-metyl-2-tiouracil, 2-tiouracil, 4-tiouracil, 5-metyluracil, uracil-5- oksyeddiksyremetylester, 3-(3-amino-3-N-2-karboksypropyl) uracil, (acp3)2, 2,6- diaminopurin, og 5-propynyl pyrimidin. Andre eksempler på modifiserte, ikkestandard, eller derivatiserte basehalvdeler kan finnes i U.S. Patent Nos. 6,001,611; 5,955,589; 5,844,106; 5,789,562; 5,750,343; 5,728,525; og 5,679,785.

9 8 [0027] Dessuten kan en nukleinsyre, polynukleotid eller oligonukleotid inneholde en eller flere modifiserte sukkerhalvdeler inkludert, men ikke begrenset til, arabinose, 2- fluorarabinose, xylose, og en heksose. Introduksjon [0028] Oppfinnelsen fremskaffer en V600E diagnoseanalyse for bruk til utvelging av kreftpasienter, f.eks., melanoma kreftpasienter, tykktarmskreftpasienter, skjoldbruskkjertelkreftpasienter og pasienter som har lavgrads serøs eggstokk-kreft, som kandidater for behandling med en B-Raf inhibitor, slik som en selektiv mutant B-Raf inhibitor, f.eks., PLX4032. Dermed kan diagnosetesten brukes til å klassifisere pasienter i henhold til deres mulighet til å svare på behandling med PLX4032. [0029] Vanligvis oppdages V600E mutasjonen (også kjent som V599E (1796T>A)) ved å bruke en metode som omfatter fastsettelsen av tilstedeværelsen av en enkel basemutasjon (T>A) ved nukleotidposisjon 1799 i kodon 600 av ekson 15. Denne mutasjonen kan også resultere fra to-basemutasjonen TG>AA ved nukleotidposisjonene To-basemutasjonen kan også oppdages ved å evaluere posisjon I noen utførelsesformer kan en nukleinsyre også evalueres for tilstedeværelsen av en substitusjon ved posisjon [0030] Andre mutasjoner kan inntreffe i kodon 600. Disse inkluderer V600K, V600D, og V600R. I noen utførelsesformer kan en probe som oppdager en V600E mutasjon også oppdage andre 600 mutasjoner, f.eks., V600D, V600K og/eller V600R. I noen utførelsesformer kan en probe også oppdage en mutasjon i kodon 601. [0031] Tilstedeværelsen av en V600E mutasjon fastslås vanligvis ved å undersøke nukleinsyrer, f.eks., genomisk DNA eller mrna, for tilstedeværelsen av en basesubstitusjon ved posisjon Et stort utvalg av analyser er tilgjengelig. I noen utførelsesformer er analysen en 5 nukleaseanalyse. [0032] V600E kan også oppdages ved å oppdage tilstedeværelsen av en mutant V600E B-Raf, f.eks., ved å bruke en immunologisk analyse. [0033] Tilstedeværelsen av V600E indikerer at pasienten er en kandidat for behandling med en B-Raf inhibitor, slik som en mutasjonsspesifikk B-Raf inhibitor. Derfor omfatter oppfinnelsen også en metode hvor en pasient som det er fastslått at har en V600E mutasjon er behandlet med en B-Raf inhibitor, slik som en mutasjonsspesifikk B-Raf inhibitor, f.eks., PLX4032.

10 9 Biologisk prøve [0034] V600E mutasjonen kan oppdages i flere typer kreft, inkludert melanoma, kolorektalkreft; skjoldbukskjertelkreft, f.eks., papillær skjoldbukskjertelkreft; og eggstokkreft, f.eks. lavgrads serøs karcinom. I noen utførelsesformer oppdages V600E i lungekreft, hjernesvulster, prostatakreft, brystkreft, sarkom, leverkreft, hypofysekreft, og krefttyper som inntreffer i tykktarmen, galleveien, øyet, bukspyttkjertelen, magen, det sentrale nervesystemet, hematopoetisk og lymfoid vev. [0035] En V600E mutasjon oppdages i en biologisk prøve fra en pasient. Den biologiske prøven inneholder vanligvis en kreftcelle. For eksempel kan prøven være en tumorbiopsi, f.eks., av en ondartet melanocytisk neoplasma, en kolorektalkreft, eller en skjoldbukskjertelkreft; eller fra en vevprøve fra et metastatisk sted. I andre utførelsesformer kan den biologiske prøven være blod eller andre væsker, hvor væsken inneholder en kreftcelle. I andre utførelsesformer kan den biologiske prøven inneholde sirkulerende (cellefrie) nukleinsyrer. [0036] Mutasjonen oppdages ofte i nukleinsyrer som oppnås fra den biologiske prøven. Nukleinsyren evalueres for tilstedeværelsen av en mutasjon som kan være RNA eller DNA. I noen utførelsesformer oppdages mutasjonen i genomisk DNA. [0037] En biologisk prøve kan oppnås ved å bruke en hvilken som helst metode i fagfeltet. Videre kan en biologisk prøve behandles med et fiksativ slik som formaldehyd og innleiret i parafin og seksjonert for bruk. Alternativt kan fersk eller frossent vev benyttes. I andre utførelsesformer kan finnålsaspirater brukes. Oppdagelse av en V600E mutasjon i en nukleinsyresekvens [0038] Oppdagelsesteknikker for evaluering av nukleinsyrer for tilstedeværelse av en V600E mutasjon involverer velkjente prosedyrer innen molekylær genetikk. Videre involverer mange av metodene amplifikasjon av nukleinsyrer. Rikelig veiledning for å utføre slike prosedyrer fremskaffes i fagfeltet. Eksempler på referanser inkluderer manualer slik som PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification (ed. H. A. Erlich, Freeman Press, NY, N.Y., 1992); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (eds. Innis, et al., Academic Press, San Diego, Calif., 1990); Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, , inkludert tilleggsoppgraderinger til april 2004; Sambrook & Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd Ed, 2001). [0039] Selv om metodene vanligvis benytter PCR skritt, kan andre amplifikasjonsprotokoller også brukes. Egnede amplifikasjonsmetoder inkluderer ligase kjedereaksjon (se, f.eks., Wu & Wallace, Genomics 4: , 1988);

11 10 trådforskyvingsanalyser (se, f.eks., Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: , 1992; U.S. Pat. No. 5,455,166); og flere amplifikasjonssystemer basert på transkripsjon, inkludert metodene beskrevet i U.S. Pat. Nos. 5,437,990; 5,409,818; og 5,399,491; og selvforsynt sekvensreplikasjon (3SR) (Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: , 1990; WO 92/08800). Alternativt kan metoder som amplifiserer proben til nivåer hvor den kan oppdages brukes, slik som Qβ-replikase amplifikasjon (framer & Lizardi, Nature 339: , 1989; Lomeli et al., Clin. Chem. 35: , 1989). En gjennomgang av kjente amplifikasjonsmetoder er fremskaffet, for eksempel, av Abramson og Myers i Current Opinion in Biotechnology 4:41-47, [0040] Vanligvis utføres oppdagelsen av V600E ved å evaluere nukleinsyrer fra pasienten i en analyse som inneholder oligonukleotidprimere og/eller prober. Oligonukleotider kan fremstilles med enhver egnet metode, vanligvis kjemisk syntese. Oligonukleotider kan syntetiseres ved å bruke kommersielt tilgjengelige reagenser og apparater. Alternativt kan de kjøpes gjennom kommersielle kilder. Metoder for syntetisering av oligonukleotider er velkjente i fagfeltet (se, f.eks. Narang et al., Meth. Enzymol. 68:90-99, 1979; Brown et al., Meth. Enzymol. 68: , 1979; Beaucage et al., Tetrahedron Lett. 22: ; 1981; og den solide støttemetoden fra U.S. Pat. No. 4,458,066). I tillegg kan modifiseringer av metodene beskrevet over brukes til å påvirke oppførselen til enzymet på en ønskelig måte med hensyn til de syntetiserte oligonukleotidene. For eksempel, inkorporasjon av modifiserte fosfodiesterkoplinger (f.eks., fosfotioat, metylfosfonat, fosfoamidat, eller boranfosfat) eller andre koplinger enn et fosforsyre-derivat til en oligonukleotid kan brukes til å forhindre spalting ved et valgt sted. I tillegg, bruken av 2 -amino modifiserte sukker har en tendens til å favorisere forflytting fremfor nedbryting av oligonukleotidet når den er hybridisert med en nukleinsyre som også er malen for syntese av en ny nukleinsyretråd. [0041] De fleste analyser for å oppdage en V600E mutasjon på nukleinsyrenivå innebærer en av flere generelle protokoller: hybridisering ved å bruke allelspesifikke oligonukleotider, primerforlengelse, allelspesifikk ligasjon, sekvensering, eller elektroforetiske separasjonsteknikker, f.eks., enkelttrådet konformasjonspolymorfisme (SSCP) og heterodupleks analyser. Eksempler på analyser inkludere 5 nukleaseanalyser, mal-rettet fargestoff-terminator innlemmelse, molekylær signallys allelspesifikk oligonukleotidanalyse, enkeltbase forlengelse analyse, og mutasjonsanalyser som bruker pyrofosfatsekvensering i sanntid. Analyser av amplifiserte sekvenser kan utføres ved å bruke forskjellige teknikker slik som mikrobrikker, fluorescerende polariseringsanalyser, og matrise-assisterte laser desorpsjonsionisering (MALDI) massespektrometri. Ytterligere to metoder som kan brukes er analyser basert

12 11 på en invasiv spalting med Flap nukleaser og metodelære som benytter hengelås prober. [0042] Fastsettelse av tilstedeværelsen eller fraværet av en V600E allel utføres vanligvis ved å analysere en nukleinsyreprøve som oppnås fra en biologisk prøve som inneholder kreftceller fra en pasient som skal analyseres. Ofte inneholder nukleinsyreprøven genomisk DNA. Det genomiske DNAet oppnås vanligvis fra tumorprøver, men kan også oppnås fra andre celler eller vev, f.eks., fra et metastatisk område eller blod. [0043] Nukleinsyreprøven som skal analyseres kan også være RNA. For eksempel kan mrna fra en biologisk prøve analyseres for å fastsette tilstedeværelsen eller fraværet av en V600E mutasjon. Nukleinsyreprøven oppnås fra prøver hvor den ønskede nukleinsyren er uttrykt, f.eks., en primærtumor eller vev fra et metastatisk område. En slik analyse kan utføres ved først å omvendt-transkribere mål-rnaet ved å bruke, for eksempel, en virus omvendt-transkriptase, og deretter amplifisere det resulterende cdnaet; eller ved å bruke en kombinert høy-temperatur omvendttranskripsjons-polymerase kjedereaksjon (RT-PCR), som beskrevet i U.S. Pat. Nos. 5,310,652; 5,322,770; 5,561,058; 5,641,864; og 5,693,517. [0044] Ofte brukte metoder for å analysere nukleinsyreprøver for å oppdage nukleotidsubstitusjoner beskrives kort. Likevel, enhver metode kjent i fagfeltet kan brukes i oppfinnelsen for å oppdage tilstedeværelsen av nukleotidsubstitusjoner. Allelspesifikke prober [0045] Allelspesifikk hybridisering er avhengig av å skille mellom to DNA molekyler som er forskjellig med minst en base ved å hybridisere en oligonukleotid som er spesifikk for en av variantsekvensene til et amplifisert produkt oppnådd fra å amplifisere nukleinsyreprøven. En allelspesifikk analyse kan også omfatte to allelspesifikke oligonukleotider, f.eks., en allelspesifikk probe for den første varianten og en allelspesifikk probe for den andre varianten hvor probene hybridiserer forskjellig til en variant mot den andre. Allelspesifikk hybridisering benytter vanligvis korte oligonukleotider, f.eks., nukleotider i lengde. Prinsipp og veiledning for å designe slik prober er tilgjengelig i fagfeltet, f.eks., i referansene som siteres her. Hybridiseringsforhold burde være tilstrekkelig strenge slik at det er en betydelig forskjell i hybridiseringsintensitet mellom allelene, og fortrinnsvis en essensiell binær reaksjon, hvor en probe hybridiserer til kun en av allelene. Noen prober er designet for å hybridisere til et segment av mål-dna slik at området av interesse, som er nukleotidposisjon 1799 i kodon 600 av ekson 15 av BRAF, justeres med en sentral posisjon (f.eks., i en 15-base oligonukleotid ved 7ende posisjon; i en 16-base

13 12 oligonukleotid ved enten posisjon 8 eller 9) av proben, men denne designen er ikke nødvendig. [0046] Mengden og/eller tilstedeværelsen av en allel fastsettes ved å måle mengden av allelspesifikk probe som hybridiseres med prøven. Vanligvis er oligonukleotidet merket med et merke slik som et fluorescerende merke. For eksempel, en allelspesifikk probe som er spesifikk for en V600E nukleotidsubstitusjon hybridiseres med nukleinsyrer oppnådd fra en biologisk prøve under hybridiseringsforhold som resulterer i en fortrinnsberettiget hybridisering med en allel. Fluorescerende intensitet måles for å fastslå om spesifikke oligonukleotider har hybridisert. [0047] I en utførelsesform av redegjørelsen identifiseres nukleotidet som er på V600E posisjonen ved hybridisering under sekvensspesifikke hybridiseringsforhold med en oligonukleotidprobe som er nøyaktig komplementær til mutasjons (eller villtype) sekvensen av BRAF som inneholder V600E mutasjonsstedet. Probe hybridiseringssekvensen og sekvensspesifikke hybridiseringsforhold velges slik at et enkelt misforhold i mutasjonsstedet destabiliserer hybridiseringsdupleksene tilstrekkelig slik at de på en effektiv måte ikke dannes. Dermed, under sekvensspesifikke hybridiseringsforhold, vil stabile duplekser kun dannes mellom proben og den nøyaktig komplementære allelsekvensen. Dermed, oligonukleotider fra rundt 10 til rundt 35 nukleotider i lengde, fortrinnsvis fra rundt 15 til rundt 35 nukleotider i lengde, som er nøyaktig komplementære til en allelsekvens i et område som inneslutter mutasjonsstedet, er innenfor rammen av oppfinnelsen. [0048] I en alternativ utførelsesform av redegjørelsen, identifiseres nukleotidet som er på mutasjonsstedet ved hybridisering under tilstrekkelig strenge hybridiseringsforhold med en oligonukleotid som er betydelig komplementær til mutant- eller villtypeallelet i et område som inneslutter mutasjonsstedet, og som er nøyaktig komplementær til allelet på mutasjonsstedet. På grunn av misforhold som oppstår på steder som ikke er muterte, er det misforhold med begge allelsekvenser, forskjellen på antall misforhold i en dupleks som er dannet med mål-allelsekvensen og i en dupleks som er dannet med den tilsvarende ikke-mål-allelsekvensen er det samme som når en oligonukleotid som er nøyaktig komplementær til mål-allelsekvensen brukes. I denne utførelsesformen slakkes hybridiseringsforholdende tilstrekkelig til å tillate dannelsen av stabile duplekser med mål-sekvensen, mens den samtidig opprettholder tilstrekkelig strenghet til å utelukke formasjonen av stabile duplekser med ikke-mål-sekvenser. Under slike tilstrekkelig strenge hybridiseringsforhold, vil stabile duplekser kun dannes mellom proben og målallelet. Dermed er oligonukleotider fra rundt 10 til rundt 35 nukleotider i lengde, fortrinnsvis fra rundt 15 til rundt 35 nukleotider i lengde, som er betydelig komplementære til en allelsekvens i et område som inneslutter mutasjonsstedet, og

14 13 som er nøyaktig komplementære til allelsekvensen på mutasjonsstedet, innenfor rammen til oppfinnelsen. [0049] Bruken av betydelig, istedenfor nøyaktig, komplementære oligonukleotider kan være ønskelig i analyseformat hvor optimaliseringen av hybridiseringsforhold er begrenset. For eksempel, i et multi-target immobilisert-probe analyseformat, er prober for hvert mål immobilisert på en enkel solid støtte. Hybridiseringer utføres på samme tid ved å kontakte den solide støtten med en løsning som inneholder mål-dna. Siden alle hybridiseringene utføres under identiske forhold kan ikke hybridiseringsforhold optimaliseres separat for hver probe. Inkorporasjonen av misforhold i en probe kan brukes til å justere dupleksstabilitet når analyseformatet utelukker justering av hybridiseringsforholdene. Effekten av et bestemt introdusert misforhold på dupleksstabilitet er velkjent, og dupleksstabiliteten kan rutinemessig beregnes og fastsettes fra erfaring, som beskrevet over. Egnede hybridiseringsforhold, som avhenger av den nøyaktige størrelsen og sekvensen til proben, kan velges fra erfaring ved å bruke veiledningen som fremskaffes her og som er velkjent i fagfeltet. Bruken av oligonukleotidprober til å oppdage enkelte baseparforskjeller i sekvenser beskrives i, for eksempel, Conner et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: , og U.S. Pat. Nos. 5,468,613 og 5,604,099. [0050] Den proporsjonale forandringen i stabilitet mellom et fullkomment tilpasset og et enkeltbase misforhold-hybridiseringsdupleks avhenger av lengden på de hybridiserte oligonukleotidene. Duplekser som er dannet med kortere probesekvenser destabiliseres proporsjonelt mer ved tilstedeværelsen av et misforhold. I praksis foretrekkes oligonukleotider mellom rundt 15 og rundt 35 nukleotider i lengde for sekvensspesifikk oppdagelse. Videre, fordi endene av en hybridisert oligonukleotid gjennomgår løpende tilfeldige dissosiasjoner og re-annealing på grunn av termisk energi, destabiliserer et misforhold på begge sider hybridiseringskomplekset mindre enn et misforhold som skjer internt. Fortrinnsvis, for diskriminering av et enkelt basepar i mål-sekvensen, velges probesekvensen som hybridiserer med mål-sekvensen slik av mutasjonsstedet havner i det interne området av proben. [0051] Kriteriene over for å velge en probesekvens som hybridiserer BRAF gjelder for hybridiseringsområdet for en probe, dvs., delen av proben som er involvert i hybridisering med mål-sekvensen. En probe kan bindes til ytterligere en nukleinsyresekvens, slik som en poly-t hale som brukes til å immobilisere proben, uten å betydelig forandre hybridiseringskarakteristikkene til proben. En fagperson vil gjenkjenne at for bruk i de foreliggende metodene at en probe som er bundet til ytterligere en nukleinsyresekvens som ikke er komplementær til mål-sekvensen og, dermed, ikke involvert i hybridiseringen, er essensielt tilsvarende en ubundet probe.

15 14 5 -nukleaseanalyse [0052] I noen utførelsesformer undersøkes nukleinsyreprøvene for tilstedeværelse av en V600E mutasjon ved å bruke «TaqMan» eller «5 -nukleaseanalyse», som beskrevet i U.S. Pat. Nos. 5,210,015; 5,487,972; og 5,804,375; og Holland et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: I TaqMan analysen er merkede oppdagelsesprober som hybridiserer i det amplifiserte området tilstede under amplifikasjonsreaksjonen. Probene modifiseres slik at det unngås at probene fungerer som primere for DNA syntese. Amplifiseringen utføres ved å bruke en DNA polymerase som har 5 til 3 eksonukleaseaktivitet. Under hvert synteseskritt av amplifiseringen, nedbrytes enhver probe som hybridiserer med mål-nukleinsyren nedstrøms fra primeren som forlenges av 5 til 3 eksonukleaseaktiviteten til DNA polymerasen. Dermed resulterer syntesen av en ny mål-tråd også i nedbrytingen av en probe, og akkumuleringen av nedbrytningsprodukt tilveiebringer et mål på syntesen av mål-sekvenser. [0053] Hybridiseringsproben som brukes i analysen kan være en allelspesifikk probe som skiller mellom mutant- og villtypeallelene av BRAF på mutasjonsstedet. Alternativt kan metoden utføres ved å bruke en allelspesifikk primer og en merket probe som binder til amplifisert produkt. [0054] Enhver egnet metode for oppdagelse av nedbrytningsprodukt kan brukes i en 5 nukleaseanalyse. Ofte er oppdagelsesproben merket med to fluorescerende fargestoffer, én som er i stand til å slukke fluorescensen til det andre fargestoffet. Fargestoffene festes til proben, fortrinnsvis er en festet til 5 terminalen og den andre er festet til et internt sted, slik at slukkingen skjer når proben er i et uhybridisert stadium og slik at spaltingen av proben av 5 til 3 eksonukleaseaktiviten til DNA polymerasen skjer mellom de to fargestoffene. Amplifisering resulterer i spalting av proben mellom fargestoffene med en medvirkende eliminasjon av slukkingen og en økning i observerbar fluorescens fra fargestoffet som i utgangspunktet var slukket. Akkumuleringen av nedbrytningsprodukt observeres ved å måle økningen av fluorescens fra reaksjonen. U.S. Pat. Nos. 5,491,063 og 5,571,673 beskriver alternative metoder for å oppdage nedbrytingen av proben som skjer sammen med amplifikasjonen. [0055] I en utførelsesform, kan en 5 nukleaseanalyse utføres for å evaluere pasientprøver for tilstedeværelsen av V600E mutasjonen i BRAF ved å bruke de følgende primerne, eller sekvenser som er tilnærmet identiske med primerne: TTS068-BRAF_F1: 5 CCTCACAGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTE 3 (E= t-butyl benzyl da) (SEQ ID NO:25)

16 15 RL_BRAF_R5: 5 TAGCCTCAATTCTTACCATCCACAAAA 3 (SEQ ID NO:4). [0056] Sekvenser som er tilnærmet identiske med primersekvensene inkluderer de som hybridiserer med de samme komplementære sekvensene. Dermed, i noen utførelsesformer, inneholder primersekvensene for bruk i oppfinnelsen minst 15 sammenhengende nukleotider, noen ganger minst, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, eller 26 sammenhengende nukleotider fra TTS068-BRAF_F1 eller RL_BRAF_R5. I noen utførelsesformer har en primer minst 27, 28, 29, eller 30 sammenhengende nukleotider fra TTS068-BRAF_F1. I andre utførelsesformer er primere for bruk i oppfinnelsen minst 80 % identisk, i noen utførelsesformer minst 85 % identisk, og i andre utførelsesformer minst 90 % eller mer identisk med TTS068-BRAF_F1 eller RL_BRAF_R5. I noen utførelsesformer er forward primeren TTS068-BRAF_F1 og revers primeren er en primer som tillater adskillelse fra X kromosom pseudogen, men som ikke overlapper med RL_BRAF_R5, eller har mindre enn 10 basepar overlapp med RL_BRAF_R5. I noen utførelsesformer, kan revers primeren binde til et sted som inkluderer 20 nukleotider eller færre nedstrøms for bindestedet til RL_BRAF_R5. For eksempel, de følgende revers primersekvensene kan også brukes: 5 A AAT AGC CTC AAT TCT TAC CAT CCA CAA AA 3 (SEQ ID NO:12) 5 TAG CCT CAA TTC TTA CCA TCC ACA AAA 3 (SEQ ID NO:13) 5 TAG CCT CAA TTC TTA CCA TCC ACA AAE 3 (SEQ ID NO: 1) 5 AGG GCC AAA AAT TTA ATC AGT GGA AAA A 3 (SEQ ID NO:15) 5 CAG TGG AAA AAT AGC CTC AAT TCT TAC CA 3 (SEQ ID NO:16) [0057] I noen utførelsesformer kan forward primeren binde til et sted som inkluderer 20 baser oppstrøms fra bindestedet til BRAF-F1. I noen utførelsesformer kan forward primeren være: 5 TTTCTTCATGAAGACCTCACAGTAAAAATE 3 (SEQ ID NO:17); eller

17 16 5 ATATATTTCTTCATGAAGACCTCACAGTAAE 3 (SEQ ID NO:18). [0058] En V600E mutasjon kan også oppdages med RNA som start mal. En slik analyse kan omfatte en revers primer, f.eks., en primer som inneholder en sekvens: 5 ATG ACT TCT GGT GCC ATC CAC AA 3 (SEQ ID NO:19). [0059] Andre revers primere som kan brukes inkluderer: 5 AAA AAT AGC CTC AAT TCT TAC CAT CCA CAA AA 3 (SEQ ID NO:20); 5 GCC ATC CAC AAA ATG GAT CCA GAC A3 (SEQ ID NO:21); eller 5 CAA AAT GGA TCC AGA CAA CTG TTC AAA 3 (SEQ ID NO:22). [0060] I en utførelsesform av oppfinnelsen utføres en 5 nukleaseanalyse ved å bruke en eller begge av de følgende allelspesifikke probene, som oppdager enten en mutant (TTS 115-BRAF_MU) eller villtype (TTS148-BRAF_WTs) sekvens: TTS155-BRAF_MU 5 QCTACAIAIFAAATCTCGATGGAGTGGGTCCCAP 3 (SEQ ID NO:23) TTS 148-BRAF_WT 5 QACAITGEAAATCTCGATGGAGTGGGTCCCAP 3 (SEQ ID NO:24) (E = HEX Reporter fargestoff, F = FAM Reporter fargestoff, I = deoksyinosin, Q = BHQ2 Slukker fargestoff, P = 3 -fosfat). Fargestoffene (F eller E) settes inn mellom enten di og da (TTS155-BRAF_MU) eller mellom dg og da (TTS148-BRAF_WT). [0061] Som det forstås i fagfeltet kan en TTS155-BRAF_MU eller TTS148- BRAF_WT probe også inkludere modifikasjoner, f.eks., et spesielt fluorescerende fargestoff, slukkeren, og/eller posisjonen til fargestoffene, som er forskjellig fra de som skisseres over. [0062] I noen utførelsesformer oppdager proben som oppdager V600E, f.eks., TTS155-BRAF_MU, også V600D (1799_1800TG>AT) og V600K

18 17 (1798_1799GT>AA). I noen utførelsesformer oppdager også en probe som oppdager en V600E mutasjon K601 E (1801A>G) og V600R (1798_1799GT>AG). [0063] I noen utførelsesformer av redegjørelsen kan en sekvens som er betydelig identisk til en probesekvens brukes. Sekvenser som er betydelig identiske til probesekvensen inkluderer de som hybridiserer med den samme komplementære sekvensen som proben. Dermed, i noen utførelsesformer, omfatter probesekvenser for bruk i oppfinnelsen minst 15 sammenhengende nukleotider, noen ganger minst 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 eller 30 sammenhengende nukleotider fra TTS 155-BRAF_MU eller TTS 148-BRAF_WT. I noen utførelsesformer har en primer minst 27, 28, 29 eller 30 sammenhengende nukleotider fra TTS 155- BRAF_MU eller TTS 148-BRAF_WT. I andre utførelsesformer er primere for bruk i oppfinnelsen minst 80 % identiske, i noen utførelsesformer minst 85 % identiske, og i andre utførelsesformer minst 90 % eller mer identiske med TTS 155-BRAF_MU eller TTS 148-BRAF_WT. [0064] En 5 nukleaseanalyse for oppdaging av en V600E mutasjon i BRAF kan benytte enhver polymerase som har en 5 til 3 eksonukleaseaktivitet. Dermed, i noen utførelsesformer, er polymerasene med 5 -nukleaseaktivitet termostabile og termoaktive nukleinsyrepolymeraser. Slike termostabile polymeraser inkluderer, men er ikke begrenset til, naturlige og rekombinante former av polymeraser fra flere arter av eubakterieslektene Thermus, Thermatoge, og Thermosipho, samt kimære former derav. For eksempel, polymeraser fra Thermus arten som kan brukes i metoden ifølge oppfinnelsen inkluderer Thermus aquaticus (Taq) DNA polymerase, Thermus thermophilus (Tth) DNA polymerase, Thermus art Z05 (Z05) DNA polymerase, Thermus art sps17 (sps17), og Thermus art Z05 (f.eks., beskrevet i U.S. Pat. Nos. 5,405,774; 5,352,600; 5,079,352; 4,889,818; 5,466,591; 5,618,711; 5,674,738, og 5,795,762). Thermatoga polymeraser som kan brukes i metodene ifølge oppfinnelsen inkluderer, for eksempel, Thermatoga maritima DNA polymerase og Thermatoga neapolitana DNA polymerase, og et eksempel på en Thermosipho polymerase som kan brukes er Thermosipho africanus DNA polymerase. Sekvensene til Thermatoga maritima og Thermosipho africanus DNA polymerase er publisert i den Internasjonale Patent Publikasjonen WO 92/ Sekvensen til Thermatoga neapolitana kan finnes i den Internasjonale Patent Publikasjonen No. WO 97/ [0065] I 5 nukleaseanalysen skjer amplifikasjonsoppdagelsen vanligvis samtidig med amplifiseringen (dvs., i «sanntid»). I noen utførelsesformer er amplifikasjonsoppdagelsen kvantitative, og amplifikasjonsoppdagelsen er i sanntid. I noen utførelsesformer er amplifikasjonsoppdagelsen kvalitative (f.eks., sluttpunkt oppdagelse av tilstedeværelsen eller fraværet av en mål-nukleinsyre). I noen utførelsesformer følger amplifikasjonsoppdagelsen amplifikasjonen.

19 18 [0066] Proben kan merkes med et hvilket som helst antall merker, men det er vanligvis et fluorescerende merke. I noen utførelsesformer velges fluorforhalvdelen fra gruppen bestående av fargestoffer fra fluorescein-familen, fargestoffer fra polyhalofluorescein-familien, fargestoffer fra heksaklorfluorescein-familien, fargestoffer fra kumarin-familien, fargestoffer fra rhodamin-familien, fargestoffer fra cyanin-familien, fargestoffer fra oksazin-familien, fargestoffer fra tiazin-familien, fargestoffer fra squarain-familien, fargestoffer fra chelatert lantanid-familien, fargestoffer fra azo-familien, fargestoffer fra trifenylmetan-familien, og fargestoffer fra BODIPY -familien. [0067] Analysen omfatter ofte en probe merket med et fluorescerende merke og en slukkerhalvdel. I noen utførelsesformer, velges slukkerhalvdelen fra gruppen bestående av fargestoffer fra fluorescein-familien, fargestoffer fra polyhalofluoresceinfamilien, fargestoffer fra heksaklorfluorescein-familien, fargestoffer fra kumarinfamilien, fargestoffer fra rhodamin-familien, fargestoffer fra cyanin-familien, fargestoffer fra oksazin-familien, fargestoffer fra tiazin-familien, fargestoffer fra squarain-familien, fargestoffer fra chelatert lantanid-familien, fargestoffer fra BODIPY -familien, fargestoffer fra azo-familien, fargestoffer fra trifenylmetanfamilien, svakt-fluorescerende slukkerhalvdeler (dvs., «dim donorer») og ikkefluorescerende slukkerhalvdeler (f.eks. såkalte «mørke slukkere» inkludert Black Hole Quenchers (BHQ)). [0068] I en utførelsesform er den fluorfore halvdelen et fargestoff fra fluoresceinfamilien og slukkerhalvdelen er et fargestoff fra cyanin-familien. I en utførelsesform er den fluorfore halvdelen et fargestoff fra fluorescein-familien og slukkerhalvdelen er et fargestoff fra heksaklorfluorescein-familien. I en utførelsesform er den fluorfore halvdelen et fargestoff fra heksaklorfluorescein-familien og slukkerhalvdelen et fargestoff fra cyanin-familien. I en utførelsesform er slukkeren en mørk slukker, for eksempel, en BHQ-1, en BHQ-2 eller en BHQ-3 (Biosearch Technologies, Novato, CA). I en utførelsesform er den fluorfore halvdelen et fargestoff fra fluoresceinfamilien eller et fargestoff fra cyanin-familien og slukkerhalvdelen er en mørk slukker. Immobiliserte støtter [0069] I noen utførelsesformer utføres allelspesifikk hybridisering i et analyseformat som bruker et immobilisert mål eller en immobilisert probe. Slike formater er kjent i fagfeltet og inkluderer, f.eks., dotplot formater og omvendte dotplot analyseformater som beskrives i U.S. Pat. Nos. 5,310,893; 5,451,512; 5,468,613; og 5,604,099.

20 19 Allelspesifikke primere [0070] Tilstedeværelsen eller fraværet av en V600E mutasjon kan oppdages ved å bruke allelspesifikk amplifikasjon eller primer-forlengelsesmetoder. Disse reaksjonene involverer vanligvis bruk av primere som designes til spesifikt å utpeke mutant (eller villtype) stedet via et misforhold ved 3 enden av en primer, f.eks., ved 3 nukleotidet eller det nest siste 3 nukleotidet. Tilstedeværelsen av et misforhold påvirker evnen til en polymerase å forlenge en primer når polymerasen mangler feilrettingsaktiviteter. For eksempel, for å oppdage en V600E mutantsekvens ved å bruke en allelspesifikk amplifikasjons- eller forlengingsbasertmetode, en primer som er komplementær til mutantallelet A ved nukleotidposisjon 1799 i kodon 600 av BRAF designes slik at nukleotidet ved 3 terminalen hybridiserer ved mutantposisjonen. Tilstedeværelsen av mutantallelet kan fastsettes ved primerens evne til å starte forlengingen. Hvis 3 terminusen ikke samsvarer er forlengingen hindret. Dermed, for eksempel, hvis en primer samsvarer med mutantallelnukleotidet ved 3 enden, vil primeren effektivt forlenges. Amplifikasjon kan også utføres ved å bruke en allelspesifikk primer som er spesifikk for BRAF villtypesekvensen ved posisjon [0071] Vanligvis brukes primeren sammen med en andre primer i en amplifikasjonsreaksjon. Den andre primeren hybridiserer ved et sted som ikke er relatert til mutasjonsposisjonen. Amplifikasjon fortsetter fra de to primerne som fører til et produkt som kan oppdages som betyr at den spesielle allelformen er tilstede. Allelspesifikk amplifikasjons- eller forlengelse-baserte metoder beskrives i, for eksempel, WO 93/22456; U.S. Pat. Nos. 5,137,806; 5,595,890; 5,639,611; og U.S. Pat. No. 4,851,331. [0072] Bruken av allelspesifikk amplifiseringsbasert genotyping, identifiseringen av allelene krever kun oppdagelsen av tilstedeværelsen eller fraværet av de amplifiserte mål-sekvensene. Metoder for oppdaging av amplifiserte mål-sekvenser er velkjente i fagfeltet. For eksempel, gelelektroforese og probe hybridiseringsanalyser beskrevet er ofte brukt til å oppdage tilstedeværelsen av nukleinsyrer. [0073] I en alternativ metode uten prober, oppdages den amplifiserte nukleinsyren ved å overvåke økningen av den totale mengden av dobbelttrådet DNA i reaksjonsblandingen, og er beskrevet, f.eks., i Pat. No. 5,994,056; og Europeisk Patent Publikasjon No. 487,218 og 512,334. Oppdagelsen av dobbelttrådet DNA avhenger av økningen av fluorescerende fargestoffer som binder til DNA viser, f.eks., SYBR Grønn, når de binder til dobbelttrådet DNA. [0074] Som verdsatt av en fagperson, kan allelspesifikk amplifikasjonsmetoder utføres i en reaksjon som benytter flere allelspesifikke primere for å utpeke spesielle alleler. Primere for slike mangfoldige anvendelser er vanligvis merket med adskillelige