RAPPORT. LeppeProd. Økt mengde phospholipid i fôr til Berggylte, molekylære og proteinomiske påvirkninger på tarm og lever. Preliminære funn.

Transkript

1 LeppeProd 2012 RAPPORT Økt mengde phospholipid i fôr til Berggylte, molekylære og proteinomiske påvirkninger på tarm og lever. Preliminære funn. Øystein Sæle, Andreas Nordgreen, Josef Rasinger, Anne-Berit Skiftesvik, Ingegjerd Opstad, Kristin Hamre NIFES, Nofima, Havforskningsinstituttet

2 Hovedkonklusjon Gener som er involvert i PL remodellering oppreguleres når man øker PL/TAG ratioen, men upåvirket av fôring. Gener som er involvert i ny-syntese av PL er nærmets upåvirket av mengde PL i fôret, og oppregulert etter måltid. Genetiske markører for chylomicronbygging ser ut til å bli nedregulert ved økt PL/TAG. Markøren for lagring av TAG ser ut til kun å være regulert av fôring, og er upåvirket av mindre TAG i maten. Med tanke på at fisken ser ut til å oppregulere kapasiteten til å remodellere PL (sette inn en ny fettsyre i den posisjonen på PL der man oftest finner PUFAer) når man øker PL i fôret, vil det være interessant å se om man kan tilføre PUFA i form av olje som kilde til PUFA i PL. Da kan man bruke billige ikke marine PL kilder, uten at dette får negative konsekvenser for PL kvaliteten i fisken.

3 Effekt av phospholipid i fôr til Berggylte Innledning Berggylte er en mageløs fisk. Der andre marine fiskelarver går gjennom en metamorfose med utvikling av mage, beholder Berggylte en morfologisk enkel tarm, med utseende som et rør. Tarmen er også kort, bare 50-75% av kroppslengden. Vi vet at Berggyltens føde består av evertebrater. De inneholder antagelig lite fett, noe som gir en høy andel fosfolipid (PL), som finnes i cellemembranene. Yngre stadier av copepoder, fiskelarvers viktigste naturlige byttedyr, har også en slik sammensetning. Det ble derfor i 2011 utført et forsøk der en så på effekten av å øke andelen av totallipid i fôret med PL. Effekten av forsøksfôrene på vekst var positiv (Fig. 1), og er å finne i rapporten Effekt av phospholipid og hydrolysert protein i fôr til Berggylte Der er også fôrproduksjon, forsøksbetingelser og prøvetaking beskrevet. 1,60 1,40 1,20 1,00 0,80 0,60 a Tilvekst (g) ab a PL i fôret (% av fett) b Figur 1. Tilvekst hos Berggylte gitt økende mengde fosfolipid i fôret. Startvekt på fisken var 1,0g. Data er gitt som snitt±std av gjennomsnittet i 3 kar (fra nevnte rapport). For å dra nytte av disse resultatene i produksjon av fôr, var vi nyskjerrige på hvorfor PL er en bedre lipidkilde enn triacylglycerol (TAG). Vi vet at marine fiskelarver har problemer med lipidtransport fra tarm til resten av kroppen hvis de får forlite PL i kosten. Vi tror dette har med begrenset evne til å syntetisere PL. Vi analyserte derfor genetiske markører for lipid- opptak, lagring, pakking i transport partikler (chylomikroner) og transport av disse i tarmvev hos fisk gitt de fire fôrene med økt mengde PL. Leveren er et sentralt organ i metabolismen av fett, vi har derfor analysert leverprøver fra fisk fra forsøket med gel-basert proteonomikk. Denne analysen avslører proteiner som er forskjellig regulert mellom de forskjellige behandlingene. Siden distrubisjonen av proteiner i en 2d gel ikke er karakterisert i berggylte fra før, må protein spottene isoleres fra gelen og sekvenseres.

4 Materialer og metoder Tabell 1: Råvareinnhold (% av ww) i diett 1-4 med økende mengde soya lecithine (PL) (fra Effekt av phospholipid og hydrolysert protein i fôr til Berggylte ). Diett nr: PL (% av diett) Fiskemel a 41,8 41,8 41,8 41,8 Rekemel b Hvete c 17,8 17,8 17,8 17,8 Hydrolysert fiskemel d Soy lecithin e Soy Oil f Monosodiumphosphate g Vitamin mix h 0,31 0,31 0,31 0,31 Betaine i 1,5 1,5 1,5 1,5 Mineral mix j 0,52 0,52 0,52 0,52 Yttrium k 0,05 0,05 0,05 0,05 Carop. Pink (10%) l 0,03 0,03 0,03 0,03 a LT-Fishmeal, Karmsund Fiskemel AS, Norway b Shrimp powder (7411), Seagarden AS, Avaldsnes Norway c Wheat grain (510130), Norgesmøllene AS, Nesttun Norway. d See text. e Soylecithin GMO powder (20022), Agrosom, Mölln Germany f Mills Soy oil. Mills DA, Sofienberg, Norway. g D IE -kg, E 160 mg -kg, K3 20 mg -kg, C 500 mg -kg, B1 20 mg -kg, B2 30 mg -kg, B6 25 mg -kg, B12 5 µg -kg, B5 60 mg -kg, 200 mg -kg Taurine, Folic acid 10 mg -kg, Niacin 200 mg -kg, Biotin 1 mg -kg, h BOLIFOR MSP, Yara AS, Norway. i Betafin S1, Danisco Animal Nutrition, Helsinki Finland. j Mn 30 mg -kg,, Mg 750 mg -kg, Fe 60 mg -kg, Zn mg -kg, 120 mg -kg, Cu 6 mg -kg, K 800 mg -kg, Se 0,3 mg -kg. k Yttrium(III) oxide, Reacton 99,99 %. Alfa Aesar, Ward Hill USA. l Carophyll Pink (10 %),DSM, Basel Switzerland. Tabell 2: Næringsinnhold (% av dw) i diett 1-4 med økende mengde soyalecithin (PL). Diett PL (% av diett) Protein 55,0 55,7 55,9 56,1 Aske 13,8 13,8 14,0 14,1 Fett (Bligh and Dyer) 17,6 17,1 17,1 16,3 Analysert PL (% av fett)

5 Hele tarmer og lever fra 6 fisk fra hvert kar ble dissekert ut og fryst ned på flytende nitrogen. De frosne prøvene ble så homogenisert på flytende nitrogen og delt i 3 fraksjoner; en til RNA rensing, en til proteonomikk og en til reserve. Det ble tatt prøver av fisk foret med fôr 1 og 3 før og etter fôring, men bare etter fôring av fisk gitt fôr 2 og 4. Genuttrykk ble så målt med kvantitativ qpcr i henhold til etablerte metoder ved NIFES. Gensekvenser ble hentet fra contig assembly basert på transkriptomet til hel fisk som er laget ved NIFES i Genene; RPL37 og ubiquitin ble brukt til å normalisere genuttrykkene til målgenene. Proteiner ble separert på 2d geler. Forskjellige geler ble farget med forskjellige fluoriserende farger slik at forskjellige prøver kan skilles basert på farge, og mengden protein er kvantifiserbar basert på fluorosens intensitet. Resultater: Genuttrykk fra tarm viste at de fleste deler av lipidmetabolismen i tarmceller er påvirket av lipidklasse ratioen i fôrene. Se figur 2 for detaljer. Fig. 2: illustrasjon av en tarmcelle (enterocytt) der noen nøkkelproteiner for opptak og transport av fett er illustrert i fargesprakende former. Hvert proteins rolle er markert i figuren. mrna uttrykket til de forskjellige proteinene i fisk gitt de fire diettene er gitt i grafene på sidene av tarmcellen.

6 De foreløpige resultatene fra proteomikk analysen er fremstilt i ett Venn diagram, der fôr 1 er definert som kontrollfôr. Fôr 1 v.s. fôr 2: av 1841 proteiner inkludert i analysen er 21 regulert (16 ned/5 opp). Fôr 1 v.s. fôr 3: av 1851 proteiner inkludert i analysen er 11 regulert (5 ned/6 opp). Fôr 1 v.s. fôr 4: av 1839 proteiner inkludert i analysen er 22 regulert (17 ned/6 opp). Før v.s. etter fôring: av 1670 proteiner inkludert i analysen er 192 regulert (34 ned/158 opp). Fig. 3: Venndiagram av proteinregulering i lever. Tall angir hvor mange proteiner som er forskjellig regulert i behandlingene. Blå oval: fôr 1 v.s. fôr 2, Gul oval: fôr 1 v.s. fôr 3, Grønn oval: fôr 1 v.s. fôr 4, Rød oval: før v.s. etter fôring.