Analyse av kjønns og stresshormoner

Transkript

1 Analyse av kjønns og stresshormoner Sandra R. Dahl Hormonlaboratoriet, Oslo Universitetssykehus (Aker)

2 Innhold Hormonlabortoriet Hva er kjønns og stresshormoner? Medisinsk bakgrunn for analyse av steroidhormoner Utfordringer ved analyse av steroider Hvor langt har vi kommet? Konklusjon

3 Hormonlaboratoriet Over (hormon)analyser per år Rekvirenter: stortsett eksterne, dvs. fastleger/spesialister, ca. 20% intern i OUS. Anlyseteknikker: stortsett immunoassays, overført 3 metoder til LC MS/MS. Ser nasjonalt og internasjonalt at flere hormoner analyseres med LC MS (bedre spesifisitet). Ca analyser av steroidhormoner (serum, plasma, urin, spytt) analyser av steroidhormoner som vi ønsker på sikt åoverføre til LC MS

4 Kjønns og stresshormoner Kan deles inn i to grupper: 1) Steroider Produseres i ovariene/testis og binyrene kjertelhormoner, produseres lokalt 2) Proteiner Produseres i hypofysen Regulatoriske hormoner Eksempler: Adrenokortikotrop hormon (ACTH), follikkelstimulerende hormon (FSH), luteiniserende hormon (LH), prolaktin

5 Kolesterol, Mw=386,65 Pregnenolon, Mw=316,48 Progesterone, Mw=314,46 Deoxykortikosteron (DOC), Mw=330,46 Kortikosteron, 3β HSD (HSD3B2) CYP11A1 (STARD 1 og 20,22 desmolase, cholesterol side chain cleavage enzyme), hastighetsbestemmende 17αhydroxylase (CYP17A1) 21 hydroxylase (CYP21A2) 17α OHlase 17α OHlase 11βhydroxylase 2 (CYP11B2) 11β OHlase 2 17 OH Pregnenolon, Mw=316,48 17 OH Progesteron, Mw=330,46 11 deoxykortisol (11 DEO), 17α OHlase 3β HSD 21 OHlase 11β OHlase 2 11βhydroxylase 1 (CYP11B1) Steroidhormoner Dehydroepiandrosteron (DHEA), Mw=288,42 17,20 Lyase (CYP17A1) 17,20 Lyase 18 OH Kortikosteron, Mw=362,46 Androstenedion, Mw=286,42 21 deoxykortisol (21 DEO), Kortisol, Mw=362,46 3β HSD 21 OHlase 17β HSD (HSD17B3) 17β HSD Aromatase (CYP19A1) 11β HSD 1 (HSD11B1) 11β HSD 2 (HSD11B2) 11β hydroxylase 2 Androstenediol, Mw=290,44 Testosteron, Mw=288,42 Østron (Estron) Lever og placenta 3β HSD Kortison, Mw=360,44 17β HSD Aldosteron, Mw=360,44 Dihydrotestosteron (DHT), Mw=290,44 Østriol 5αreduktase (SRD5A1) Aromatase Østradiol, Mw=272,38 Lever og placenta

6 17β HSD Kortison, Mw=360,44 Kortisol, Mw=362,46 17 OH Pregnenolon, Mw=316,48 Progesterone, Mw=314,46 17 OH Progesteron, Mw=330,46 Deoxykortikosteron (DOC), Mw=330,46 Kortikosteron, 18 OH Kortikosteron, Mw=362,46 11 deoxykortisol (11 DEO), 21 deoxykortisol (21 DEO), Dehydroepiandrosteron (DHEA), Mw=288,42 Androstenedion, Mw=286,42 Aldosteron, Mw=360,44 Testosteron, Mw=288,42 Østradiol, Mw=272,38 Dihydrotestosteron (DHT), Mw=290,44 21 hydroxylase (CYP21A2) 11βhydroxylase 2 (CYP11B2) 17,20 Lyase (CYP17A1) 11β HSD 2 (HSD11B2) 5αreduktase (SRD5A1) 11βhydroxylase 1 (CYP11B1) 11β HSD 1 (HSD11B1) Steroidhormoner Steroidhormoner 3β HSD 3β HSD 17,20 Lyase Aromatase 17α OHlase 17α OHlase 11β hydroxylase 2 11β OHlase 2 21 OHlase 21 OHlase 11β OHlase 2 17α OHlase Analyseres ved Hormonlaboratoriet

7 Kjønnshormoner Stressrelaterte hormoner 17 OH Pregnenolon, Mw=316,48 Dehydroepiandrosteron (DHEA), Mw=288,42 Androstenedion, Mw=286,42 Testosteron, Mw=288,42 Dihydrotestosteron (DHT), Mw=290,44 Progesterone, Mw=314,46 17 OH Progesteron, Mw=330,46 21 deoxykortisol (21 DEO), Østradiol, Mw=272,38 Deoxykortikosteron (DOC), Mw=330,46 11 deoxykortisol (11 DEO), Kortisol, Mw=362,46 Kortison, Mw=360,44 Kortikosteron, 18 OH Kortikosteron, Mw=362,46 Aldosteron, Mw=360,44

8 LC MS analyse 17 OH Pregnenolon, Mw=316,48 Dehydroepiandrosteron (DHEA), Mw=288,42 Androstenedion, Mw=286,42 Testosteron, Mw=288,42 Dihydrotestosteron (DHT), Mw=290,44 17 OH Progesteron, Mw=330,46 21 deoxykortisol (21 DEO), Deoxykortikosteron (DOC), Mw=330,46 11 deoxykortisol (11 DEO), Kortisol, Mw=362,46 Kortison, Mw=360,44 Kortikosteron, 18 OH Kortikosteron, Mw=362,46

9 Steroidhormoner Når analyseres steroidhormoner? Utrede enzymsvikt i binyrebarken Overproduksjon av kortisol Hypofysesvikt Hypertensjon Gonadesvikt Pubertetsutredning Impotens/Infertilitet Polycystisk ovarie (PCO/PCOS) kjønnsutredning Kreft (prostata/testis) oppfølging Dopingmisbruk Tumor

10 Kjønnshormoner Regulerer seksuell funksjon og utvikling av sekundære kjønnskjennetegn Gonadesvikt (svikt av eggstokkene) Pubertetsutredning Kjønnsutredning Impotens/infertilitet Polycystisk ovarie (PCO/PCOS) Kreft (prostata/testis) oppfølging Dopingmisbruk Tumor

11 Stresshormoner Mineralkortikoider Regulerer saltstoffskiftet, særlig Na + balansen Glukokortikoider (kortisol) betennelsesdempende effekt og effekt på karbohydrat, protein og fettomsetningen Utrede enzymsvikt i binyrebarken Overproduksjon av kortisol Hypofysesvikt Hypertensjon Binyre carcinom

12 Utfordringer ved analyse av steroidhormoner generellt Komplekse prøver (eks. serum, plasma, urin, spytt, spinalvæske) Mange interferenser Særlig proteiner og fosfolipider i serum og plasma Analyttene har ofte lav konsentrasjon lav pmol/l (testosteron, østradiol, aldosteron) Bundet til bindeproteiner (eks. SHBG, CBG) eller albumin skal det måles total konsentrasjon, fritt hormon, biotilgjengelig hormon? konsentrasjon av bindeproteiner? Tilgjengelig mengde prøve analyse av prøver fra små barn (nyfødte)

13 Konsentrasjonsforskjeller av små endogene molekyler Kushnir et.al (2010), Mass Spectrom Rev, 29,

14 Utfordringer ved analyse av steroidhormoner preanalytisk Konsentrasjon av kjønnshormoner avhengig av: kjønn, menstruasjonssyklus, pubertetsstadium, graviditet, alder Konsentrasjon av stresshormoner og til en viss grad kjønnshormoner avhengig av: tid på dagen (døgnvariasjon) Andre biologiske faktorer: faste, vekt, stress Tekniske faktorer: prøvemateriale, rørtype, stabilitet interferens fra hemoglobin, fett og bilirubin Ceglarek et al., J Steroid Biochem Mol Biol (2010), 121,

15 Utfordringer ved analyse av steroidhormoner prøveopparbeidelse Bindeprotein (SHBG, CBG), albumin Konjugert til glukuronid og sulfat Hvilket løsemiddel til ekstraksjon? plan: en opparbeidelse, sparer prøvemengde, særlig små barn 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 Andro (287.3 >97.1), nmol/l Hybrid SPE CA ChemElute EtAc ChemElute EtAc/eter 17 OH prog (331.1 >97.1), nmol/l Hybrid SPE CA ChemElute EtAc ChemElute EtAc/eter barn 3 5 år jenter år kvinner pre kvinner post menn barn 3 5 år jenter år kvinner pre kvinner post menn

16 LC MS analyse Plan: alle analytter i en analyse 17 OH Pregnenolon, Mw=316,48 Dehydroepiandrosteron (DHEA), Mw=288,42 Androstenedion, Mw=286,42 Testosteron, Mw=288,42 Dihydrotestosteron (DHT), Mw=290,44 17 OH Progesteron, Mw=330,46 21 deoxykortisol (21 DEO), Deoxykortikosteron (DOC), Mw=330,46 11 deoxykortisol (11 DEO), Kortisol, Mw=362,46 Kortison, Mw=360,44 Kortikosteron, 18 OH Kortikosteron, Mw=362,46

17 Utfordringer ved analyse av steroidhormoner separasjon (LC) Endogene interferenser med samme masse ( isobarer ) epimerer (= diastereomerer) f. eks. testosteron andre isobarer f.eks. testosteron og DHEA; 11 deoxykortikosteron og 17α OH progesteron; 11 Deoxykortisol og Kortikosteron medikamenter f.eks. prednison, prednisolon en utfordring for separasjonen

18 Interferenser Epimerer, eksempel: testosteron Testosteron, Mw=288,42 Epi Testosteron, Mw=288,42 Isobare (samme masse) Dehydroepi androsteron (DHEA), Mw=288,42

19 Interferenser Kan endre stasjonærfasen: Mobilfasen er også viktig: C18, B= AcN eller MeOH PFP, B=AcN DHEA, testo, epitesto 2 x10 +ESI MRM Frag=380.0V CID@18.0 ( > ) _interferenser 13.d 1 PFP, B=MeOH DHEA epi testo testo Counts vs. Acquisition Time (min)

20 Temperatur og mobilfase flow Husk: temperatur og mobilfase flow påvirker også separasjonen Oppløsning er avhengig av separasjonsfaktor (α), platetallet (N) og retensjonsfaktor (k) α : forandring i SF og MF N: forandring i lengde, MF flow, dp K: MF/SF og Temperatur

21 Utfordringer ved analyse av steroidhormoner deteksjon (MS) Hvor lett ioniserbar er analytten? Lett å ionisere: lavere konsentrasjoner kan detekteres Kortisol, Mw=362,46 Testosteron, Mw=288,42 Deoxykortikosteron (DOC), Mw=330,46 Aldosteron, Mw=360, nmol/l 0,3 30 nmol/l 0,05 1 nmol/l 0,05 1 nmol/l Karbonyl (C3) med konjugert dobbeltbinding lett å ionisere (høy protonaffinitet) Vanskelig å ionisere: hormoner med lav konsentrasjon blir vanskelig ådetektere 17 OH Pregnenolon, Mw=316,48 Dehydroepiandrosteron (DHEA), Mw=288,42 Dihydrotestosteron (DHT), Mw=290,44 Østradiol, Mw=272,38 <26 nmol/l 5 32 nmol/l <1 3 nmol/l <0,05 0,2 nmol/l Hydroxyl (C3) eller karbonyl (C3) uten konjugert dobbeltbinding vanskelig å ionisere (magler protonaffinitet) Triks: se på [M H 2 O] +

22 Vår(e) metode(r) Steroidpanel 1: 11 deoxykortisol, 21 deoxykortisol, 17 hydroxyprogesteron, (17 hydroxypregnenolon), 18 hydroxykortikosteron, deoxykortikosteron, (dihydrotestosteron), kortikosteron, (kortisol), kortison Steroidpanel 2: Androstenedion, (DHEA), testosteron 300 µl serum SLE ekstraksjon med etylacetat reløsning i 100 µl (oppkonsentrering)

23 Vår(e) metode(r) Steroidpanel 1 (ikke testosteron/ androstenedion) x10 3 +ESI MRM Frag=380.0V CID@** ( > ) OH-kortikosteron 5.d 3 Separasjon på en HSS PFP kolonne (ca. 9,5 min) Mobilfaser: 0,2% maursyre (A) og MeOH/AcN/mausyre (B) Positiv elektrospray MRM (minst 2 overganger per ISTD/analytt) Counts vs. Acquisition Time (min)

24 Vår(e) metode(r) Steroidpanel 2 (testosteron/ androstenedion) x Separasjon på en HSS PFP kolonne (ca. 2,5 min) Mobilfaser: 0,2% maursyre (A) og MeOH/mausyre (B) Positiv elektrospray MRM (minst 2 overganger per ISTD/analytt) high troughput Counts vs. Acquisition Time (min)

25 Vår(e) metode(r) Fordeler: 1 ekstraksjon lite prøvemateriale (300 µl) Alle steroidhormoner med immunoassay krever ca. 3 ml serum Kan inkludere hormoner som det ikke finnes immunoassay for 18 OH kortikosteron, 21 deoxykortisol Utfordringer: Ny måte åtenke på Legene er vant med åse på svar fra en og en analyse, ikke et panel Cut off verdier og referansegrenser endrer seg

26 Eksempel congenital andrenal hyperplasia (CAH) svikt av 21 hydroxylase enzymet i binyrebarken Anbefalt: analyse av 17 OH progesteron OUS prosedyre har 3 cut off verdier for 17 OH progesteron: 6 nmol/l (basal forhøyet ved ikke klassisk CAH) 45 nmol/l (60 min etter 250 µg synachten (ACTH) 100 nmol/l (basal forhøyet ved klassisk CAH) 17 OHpregnenolon 21 hydroxylase (CYP21A2) Deoxy kortikosteron (DOC), Mw=330,46 17α OHlase 17α OHlase 17 OH Progesteron, Mw=330,46 11 deoxykortisol (11 DEO), 11β hydroxylase 2 Kortikosteron, Hvordan skal vi forholde oss til disse cut off verdiene? 21 OHlase 11β OHlase 2 11β hydroxylase 1 (CYP11B1) 11βhydroxylase 2 (CYP11B2) 21 deoxykortisol (21 DEO), Kortisol, Mw=362,46 Aldosteron, Mw=360,44 21 OHlase

27 Hvordan prøver vi åløse utfordringene? 6 nmol/l cut off, analyse med begge teknikker *kvinner/barn før pubertet Kortisol ( , barn ) 21 DEO (<0,2?) Kortikosteron (1,5 45, barn 0,5 55) 11 DEO (0,3 3) DOC (<1,9) 17 OH prog LC MS (<2,4, barn <3,3) 17 OH prog RIA Testo (<2, barn <0,9)* Andro (0,9 7,5, barn <1,0)* Klinikk 134 2,3 0,62 0,04 1,5 6,3 1,0 8,8 Kv f99, PCOS 49 0,35 <0,1 <0,2 2,6 6,8 <0,2 <0,2 gutt f 12, CAH 332 8,2 0,1 <0,2 2,3 5,1 <0,2 <0,2 Gutt f 13, beh. for CAH 211 4,0 0,37 0,08 2,4 7,1 1,3 12 Kv f88, PCOS

28 Hvordan prøver vi åløse utfordringene? få legene til åse på profil, ikke enkeltprøvene *kvinner/barn før pubertet Kortisol ( , barn ) 21 DEO (<0,2?) Kortikosteron (1,5 45, barn 0,5 55) 11 DEO (0,3 3) DOC (<1,9) 17 OH prog LC MS (<2,4, barn <3,3) 17 OH prog RIA Testo (<2, barn <0,9)* Andro (0,9 7,5, barn <1,0)* Klinikk 134 2,3 0,62 0,04 1,5 6,3 1,0 8,8 Kv f99, PCOS 49 0,35 <0,1 <0,2 2,6 6,8 <0,2 <0,2 gutt f 12, CAH 332 8,2 0,1 <0,2 2,3 5,1 <0,2 <0,2 Gutt f 13, beh. for CAH 211 4,0 0,37 0,08 2,4 7,1 1,3 12 Kv f88, PCOS

29 Synachtentester *kvinner/barn før pubertet Kortisol ( , barn ) Kortikosteron 21 DEO (<0,2?) (1,5 45, barn 0,5 55) 11 DEO (0,3 3) DOC (<1,9) 17 OH prog LC MS (<2,4, barn <3,3) 17 OH prog RIA Testo (<1,9, barn <0,6)* Andro (0,9 5,4, barn <0,9)* Klinikk ,1 1,8 4,0 57,8 0,87 5,11 0,13 2,6 0, ,8 >31 <0,2 <0,2 j f12, CAH? Forst. klitoris ,3 7,0 2,1 29,3 0,38 3,7 0,11 0,18 2,5 55 4,8 >31 1,9 2,6 6,6 14,1 Kv f89, PCOS? CAH? ,5 78,2 0,76 1,2 0,1 7,6 1,0 1,6 5,8 8,1 0,6 0,7 3,3 4,8 Kv f93, uttalt hirsutisme ,0 10 0,8 6,3 1,17 3,9 0,05 1, ,0 Ikke analysert 9,3 Ikke analysert Kv f86, CAH? Endo RH

30 Avsluttende case 17 OH progesteron kan bestilles som ø hjelp prøve : bestilles ø hjelp prøve av en liten nyfødt gutt bakgrunn: forhøyet 17 OH progesteron i nyfødtscreening (ca. 50 nmol/l, LC MS), skal dobbeltsjekkes, mistanke CAH 17 OH prog = 5 nmol/l (lett forhøyet?), andre steroider normale Startet behandling med kortisol, men hjalp ikke Ny prøve til re analyse: i samsvar med prøve 1 (Hlab), nyfødtscreening ca. 10 nmol/l (immunoassay) 1. prøve (nyfødtscreening) tatt 6 dager før 1. prøve Hlab. 17 OH prog konsentrasjon har falt betydelig i løpet av den tid ikke CAH (usikker hva som er diagnosen per i dag)

31 Konklusjon LC MS/MS blir mer og mer viktig ved analyse av kjønns og stresshormoner (steroidhormoner) pga. spesifisiteten Gåfra å tenke enkeltanalyse til å tenke profil (helheten) Store endringer i etablerte grenser/cut off er Analyseteknisk: mange skjær i sjøen Takk for oppmerksomheten!